دوره 27، شماره 4 - ( 7-1403 )
جلد 27 شماره 4 صفحات 210-205 |
برگشت به فهرست نسخه ها
Download citation:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
Noruozi Kuma Olya R, Nasri S, Farashi-banab S, Dadfar F, Dehghani N. Investigating the Expression of Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) Gene Related to Angiogenesis and Interleukin-10 in Experimental Breast Tumor Model. J Arak Uni Med Sci 2024; 27 (4) :205-210
URL: http://jams.arakmu.ac.ir/article-1-7766-fa.html
URL: http://jams.arakmu.ac.ir/article-1-7766-fa.html
نوروزی کمارعلیا رعنا، نصری سیما، فراشی بناب صمد، دادفر فرشته، دهقانی نعیمه. بررسی بیان ژن فاکتور رشد اندوتلیال عروقی مرتبط با عروق زایی و اینترلوکین-10 در مدل تجربی تومور پستان. مجله دانشگاه علوم پزشكي اراك. 1403; 27 (4) :205-210
بررسی بیان ژن فاکتور رشد اندوتلیال عروقی مرتبط با عروق زایی و اینترلوکین-10 در مدل تجربی تومور پستان
رعنا نوروزی کمارعلیا1 
، سیما نصری1 ، صمد فراشی بناب1 ، فرشته دادفر2 
، نعیمه دهقانی1
، سیما نصری1 ، صمد فراشی بناب1 ، فرشته دادفر2 ، نعیمه دهقانی1
1- گروه زیست‌شناسی، دانشگاه پیام نور، تهران، ایران
2- گروه زیست‌شناسی، دانشگاه پیام نور، تهران، ایران ،fereshtehdadfar2003@yahoo.com
2- گروه زیست‌شناسی، دانشگاه پیام نور، تهران، ایران ،
واژه‌های کلیدی: فاکتور رشد اندوتلیال عروقی،
اینترلوکین،
تومور پستان
متن کامل [PDF 1180 kb]
(1190 دریافت)
| چکیده (HTML) (3792 مشاهده)
متن کامل: (202 مشاهده)
مقدمه
سرطان پستان، یکی از شایع‌ترین انواع سرطان و یکی از مهم‌ترین عوامل مرگ و میر زنان در این رابطه می‌باشد (1). آسیب‌شناسی این بیماری چند فاکتوری است و عوامل مختلفی از جمله عوامل ژنتیکی، سابقه خانوادگی، بالا رفتن سن، عوامل هورمونی، عدم سابقه زایمان یا زایمان اول تا سن
30 سالگی، عوامل محیطی از جمله عوامل تغذیه‌ای و نحوه زندگی و استفاده از بعضی از داروهای هورمونی در ایجاد سرطان پستان به عنوان عوامل خطرزا محسوب می‌شوند، در حال حاضر در کشورهای آسیایی این بیماری به سرعت در حال گسترش است (2، 3).
مطالعات متعدد نشان داده‌اند که تقریباً 25درصد از سرطان‌ها به دلیل التهاب مزمن ناشی از عفونت یا حالت‌های التهابی با منشأهای گوناگون می‌باشد. یکی از عواملی که در گسترش تومور در سرطان پستان نقش ایفا می‌کند، التهاب می‌باشد (4) که می‌تواند منجر به بروز متاستاز، مقاومت نسبت به درمان، رشد تومور، آنژیوژنز و تولید سیتوکین‌ها شود (5). سیتوکین‌ها گلیکوپروتئین‌هایی هستند که توسط سیستم ایمنی تولید می‌شوند و نقش کلیدی را در التهاب ناشی از سرطان ایفا می‌کنند (6، 7).
اینترلوکین-10 یا Interleukin-10 (IL-10) یکی از مهم‌ترین سیتوکین‌های ضدالتهابی و تعدیل‌کننده ایمنی در پاسخ‌های ایمنی است که بر روی کروموزوم 1 قرار گرفته (8) و به وسیله سلولهای ایمنی از قبیل ماکروفاژها، لنفوسیت T و سلولهای NT ساخته می‌شود و یک فاکتور حمایت‌کننده ایمنی و ضد آنژیوژنز است (9). این فاکتور در ارتباط با سرطان پستان به صورت دوسویه عمل می‌کند، از یک طرف افزایش این سیتوکین از طریق فعال‌سازی لنفوسیت‌های T سیستوتوکسیک می‌تواند دارای اثر بازدارندگی در رشد و متاستاز سرطان پستان داشته باشد و می‌تواند رشد تومور را از طریق حمایت از سلولهای تومور در برابر پاسخ‌های ایمنی افزایش دهد و از طرف دیگر به دلیل ویژگی ضد آنژیوژنزی منجر به سرکوب رشد و گسترش تومور می‌گردد و بنابراین بیشتر نقش این سیتوکین، نقش حمایتی است (10).
خانواده فاکتورهای رشد اندوتلیال عروقی یا
(Vascular endothelial growth factor) VEGF شامل یکسری گلیکوپروتئین‌های ترشحی(VEGFA, VEGFB, VEGFC, VEGFD, PLGF) هستند که شباهت‌های بسیاری از نظر ساختاری باهم دارند (11). فاکتور رشد اندوتلیال عروقی (VEGFA) یک از فاکتورهای ترشح شده از بافت توموری است که به عنوان تنظیم‌کننده رگ‌زایی، برای رشد تومور و متاستاز ضروری می‌باشد (12). VEGF-A القاء‌کننده کلیدی توسعه عروق‌زایی از طریق فعال‌سازی گیرنده 2 VEGF می‌باشد (13). همچنین احتمالاً مهم‌ترین مسیر سیگنالینگ برای رشد عروق تومور است (14). بررسی‌های متعدد نشان داده است که عملکرد VEGF محدود به عروق زایی و نفوذپذیری عروق نیست، به عنوان مثال این ملکول می‌تواند عملکرد سلولهای ایمنی را که در محیط تومور حضور دارند را تحت تأثیر قرار دهد. گیرنده‌هایVEGF ممکن است عملکرد فیبروبلاست‌ها را در استرومای تومور تنظیم کند (15). سیگنالینگVEGF در سلولهای تومور به صورت اتوکرین و پاراکرین انجام می‌شود و این سیگنالینگ در تومورزایی و به خصوص عملکرد سلولهای بنیادی سرطان مستقل از عروق‌زایی نقش دارد (16). در مطالعه حاضر با ایجاد مدل تجربی تومور پستان در موش‌های نژاد بالب/سی، میزان بیان ژن‌های VEGF و10-IL در بافت تومور مورد ارزیابی قرار گرفت.
روش کار
در پژوهش تجربی حاضر 20 سر موش نژاد بالب/سی دوماهه با وزن 25 تا 30 انتخاب و به مدت یک هفته در حیوان‌خانه دانشگاه علوم پزشکی تهران در دمای 22 تا 26 درجه سانتی‌گراد، سیکل روشنایی- تاریکی 12 ساعته و دسترسی آزاد به آب و غذا نگهداری شدند. برای ایجاد سرطان پستان از سلولهای رده توموری اپیتلیال پستان (14T) (ATCC CRL-2539) تهیه شده از انیستتو پاستور تهران استفاده شد. سلولهای توموری پستان در محیط کشت 1640RPMI (اینویتروژن، بریتانیا) حاوی 10 درصد سرم جنین گاو (جیپکو-بریتانیا)، 2 میلی‌مول L-گلوتامین (سیگما، بریتانیا) و آنتی‌بیوتیک‌های پنی‌سیلین (U/ml 100) و استرپتومایسین (μg/ml 100) کشت داده شدند. انکوباسیون سلول‌ها در دمای C°37 انجام شد. قبل از تلقیح تومور، سلول‌ها از نظر آلودگی به مایکوپلاسما توسط کشت میکروبی بررسی شدند. موش‌ها به طور تصادفی به دو گروه شاهد و آزمایشی تقسیم شدند. در گروه شاهد هیچگونه تلقیحی صورت نگرفت و به گروه آزمایشی تومور کشت داده شده تلقیح شد. برای تلقیح تومور، سلول‌ها از فلاسک کشت سلول با تریپسینه کردن جدا شده و پس از شستشو، به تعداد 105×5 به صورت زیرجلدی با رعایت اصول اخلاقی کار با حیوانات آزمایشگاهی، در گروه آزمایشی ضمن بی‌دردی حیوان و مهار موش با زاویه 10 الی 30 درجه با سوزن مناسب با گیج 23 و حجم تزریق 25/0 میلی‌لیتر در تهی‌گاه گروه آزمایشی تزریق شدند. پس از رشد تومورها، با تهیه مقاطع هیستوپاتولوژی بافت تومور تأیید گردید. این تومور از نوع بدخیم بود در مقاطع بافتی نکروز مشاهده شد (شکل 1).
برای تهیـه بافـت تومـوری، پس از بیهوش کردن موش و برش در ناحیه تشکیل تومور، تومور برداشته شد و پـس از جـدا کـردن خـون و بافـت اضـافه، تومور استخراج شد. سه هفته بعد از تلقیح سلولهای توموری و مشاهده رشد تومور، میانگین حجم تومور در هفته سوم
mm3 4/190 بود.
شکل 1. الف- کشت سلولهای توموری پستان، ب- تومور ایجاد شده در تهی‌گاه موش، ج- بافت تومور پستان رشد کرده در تهی‌گاه موش
استخراج mRNAهای بافت تومور: برای بررسی بیان ژن‌های
10-IL و VEGF در مراحل مختلف رشد تومور، mRNA از بافت تومور استخراج شد. بدین منظور پس از القاء تومور، بافت تومور از 10 سر موش در هر گروه جداسازی شد. سپس بافت تومور با استفاده از بافر لیز‌کننده حاوی گوانیدین تیوسیانات (محلول کیازول، آمریکا) متلاشی گردید. پس از افزودن 1 میلی‌لیتر بافر لیز‌کننده و انکوباسیون به مدت ́5 دردمایC250، کلروفرم (ml2/0) اضافه شد و پس از ورتکس، میکروتیوب‌ها به مدت ́10 در دمای C25 انکوبه شدند. با سانتریفیوژ میکروتیوب‌ها (در دور g12000 به مدت ́15 در دمای C40سه فاز تشکیل شد. RNA از فاز رویی شفاف و بی‌رنگ با اضافه کردن ایزوپروپانول (ml5/0) و سپس انکوباسیون به مدت ́10 درC250 و سانتریفیوژ (با دور g12000 به مدت ́10 در دمای C40) رسوب داده شد. رسوب با اتانول (اتیل الکل) %75 (ml1) شسته شده و پس از سانتریفیوژ (در دور g7500 به مدت ́5 در دمای C40) و خشک کردن رسوب (در محیط)؛ RNA درµl 50 آب عاری از RNase حل شد. کیفیت و مقدار RNA به دست آمده با استفاده از نانودراپ (Thermoscientific, USA) با روش اسپکتروفتومتری بررسی شد. در مرحله بعد، هرگونه DNA باقیمانده در RNAهای استخراج شده با تیمار با DNase عاری از RNase (فرمنتاز، آمریکا) حذف گردید.
سنتز cDNA از mRNAهای استخراج شده از سلولهای توموری: سنتز cDNA از روی mRNAهای استخراج شده به روش (RT-PCR) توسط آنزیم رونوشت‌برداری معکوس
(Meloney-murine leukemia virus) M-MuLV (فرمنتاز، آمریکا) و پرایمرهای رندوم هگزامر وOligo dT(18) در حضور (d Nucleoside Triphosphate) dNTP و RNA guard (جدول 1) و با انکوباسیون در دماهای C250 به مدت ́5، C420 به مدت ́60 و C750 به مدت ́5 (در دستگاه ترموسیکلر، Eppendorf/England)
صورت گرفت.
جدول 1. اجزاء مسترمیکس سنتز cDNA از روی mRNAهای استخراج شده از
سلولهای توموری
Real-time RT-PCR برای بررسی میزان بیان ژن‌های 10-IL و VEGF: برای انجام Real-Time Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction) از مسترمیکس PCR (فرمنتاز-لیتوانی) شامل DNA پلیمراز Taq (Hot start)، dNTP (نوکلئوتیدهای آزاد)، منیزیم کلراید، بافر PCR حاوی کلرید پتاسیم و سولفات آمونیوم، رنگ فلورسنت سایبرگرین I و رنگ رفرانس غیرفعال ROX استفاده گردید و به آن ژن خانه‌دار (Housekeeping gene) با غلظت μM25/0 و cDNA (حدود ng500) اضافه شد (با حجم نهایی محلول واکنش μl15 چرخه‌های حرارتی شامل C950 به مدت ́10 (برای فعال‌سازی آنزیم) و به دنبال آن 45 چرخه در دو مرحله C950 به مدت ˝15 (مرحله واسرشتگی) و C600 به مدت ˝60 (مرحله اتصال-مرحله امتداد) بود که در دستگاه Applied Biosystems مدل StepOne انجام شد. برای بررسی محصول PCR پس از اتمام چرخه‌ها، آنالیز منحنی ذوب برای تأیید محصول انجام شد. پرایمرها با استفاده از نرم‌افزار open primer3source froge USA طراحی شد و با استفاده از سایت اینترنتی /https://www.ncbi.nlm. nih. Gob Blast تایید گردید. توالی پرایمرهای استفاده شده برای تکثیر IL-10 و VEGF به ترتیب زیر بود:
10-IL/F
5'-CGGACTGAGAGGACACAGGTTAC-3'
10-IL/R
VEGF/F
5′-ACCATGCCAACTTCTGTCTG-3′
VEGF/R
5′-CGGGTTGTGTTGGTTGTAGA-3′
تحلیل و تجزیه متغیرهای حاصل از بیان ژن‌های اینترلوکین-10 و فاکتور رشد اندوتلیال عروقی در گروه‌های آزمایشی با استفاده از نرم‌افزار SPSS نسخه 20 (version 20, IBM Corporation, Armonk, NY) و روش آماری T-test انجــام گرفت.
یافته‌ها
ارزیابی محصول PCR و منحنی ذوب بیان ژن‌های 10-IL و VEGF: در مطالعه حاضر کمیت و کیفیت RNAهای استخراج شده با نانودراپ در طول موج های 260، 280 و 230 نانومتر بررسی شد. نسبت جذب نوری 280/260 و 260/230 به ترتیب بین 2-8/1 و 2-5/1 بود که نشان‌دهنده کیفیت مناسب RNAهای استخراج شده بود (شکل 2).
شکل2. بررسی کیفیت و کمیت RNAهای استخراج شده با نانودراپ
پس از اتمام چرخه‌های حرارتی، منحنی ذوب مربوط به ژن‌های 10-IL و VEGF توسط دستگاه ثبت شد. برای کشیدن منحنی ذوب، دمای میکروتیوب‌ها به °C65 رسانده شد و تا °C95 افزایش یافت. این افزایش دما به ازای هر 3/0 دقیقه به میزان °C3/0 بود و میزان فلورسنس طی هر بار افزایش دما اندازه‌گیری شد و به صورت گراف ترسیم شد. همچنین تک قله‌ای بودن منحنی ذوب حاکی از عملکرد بهینه پرایمرها برای انجام واکنش RT-PCR برای ژن‌های 10-IL و VEGF بود (شکل 3).
شکل 3. منحنی ذوب مربوط به بیان ژن‌های 10-IL و VEGF پس از انجام RT-PCR
نتایج مربوط به بیان ژن‌های 10-IL و VEGF در دو گروه آزمایشی: آنالیز داده‌های حاصل از بیان ژن‌های 10-IL و VEGF نشان داد که بیان ژن 10-IL در بافت تومور نسبت به سلولهای گروه شاهد 7/4 برابر و بیان ژن VEGF 6/5 برابر نسبت به سلولهای گروه شاهد بیشتر بوده است (نمودار 1) ولی این افزایش بیان در گروه آزمایش در مقایسه با گروه شاهد از نظر آماری معنی‌دار نبود (05/0 < P).
بحث
پژوهش‌های پیشین نشان داده‌اند که اینترلوکین-10 یک سیتوکین چند عملکردی می‌باشد که نقش تعدیل‌کننده در پاسخ‌های لنفوئیدی و میلوئیدی ایفا می‌کند (17). 10-IL تولید شده توسط ماکروفاژهای وابسته به تومور در سرکوب فعالیت ضد توموری در لنفوم غیر هوچکین نیز نقش دارد (18).
نمودار 1. بررسی سطح بیان ژن‌های 10-IL و VEGF در بافت تومور پستان نسبت به گروه شاهد
افزایش بیان 10-IL در انواع مختلف سرطان انسانی مثل سرطان دهانه رحم، کولورکتال، کلیه، سرطان هپاتوسلولار و تخمدان و همچنین سرطان سلولهای سنگفرشی، سلولهای بازال پوست و گلیومای انسانی و ملانوما گزارش شده است اینترلوکین-10 در مختل کردن پاسخ ایمنی از طریق کاهش بیان (Human LeukocyAntigen I) HLA-Iو یا افزایش بیان HLA-G در تروفوبلاست انسان و مونوسیت و همچنین انواع خاصی از سرطان مثل سرطان ریه دخالت داشته است (19). به طور کلی عملکرد بیولوژیکی دوگانه 10-IL به عنوان عامل ضد التهابی (گسترش دهنده سرطان) و ضد رگ‌زایی (مهار‌کننده تومور) نشان‌دهنده اطلاعات متناقض در سرطان می‌باشد (20، 21). مطالعات Li و همکاران نشان داد که دو پلی‌مورفیسم rs1800896 و rs1800872 ژن اینترلوکین-10 به طور معنی‌داری منجر به افزایش ریسک ابتلا به سرطان پستان در بین آسیایی‌ها می‌گردد و بنابراین این پلی‌مورفیسم‌های ژن
IL-10 یک تنظیم‌کننده کلیدی در سرطان پستان می‌باشند (8).
IL-18در سرطان پستان به شدت بیان می‌شود و ارتباط مثبتی با
IL-10 دارد. هر دو IL-18 و 10-IL ممکن است ارتباط مثبتی با متاستاز به غدد لنفاوی در سرطان پستان داشته باشند (22). همچنین به نظر می‌رسد آگونیست‌ها و آنتاگونیست‌های IL-10 ممکن است از طریق مکانیسم‌های مختلف اثرات درمانی داشته باشند. علاوه بر این، پلی‌مورفیسم‌های ژن IL-10 ممکن است استعداد ابتلا به سرطان سینه را تعیین کند (9).
VEGF یک فاکتور ترشحی است که به گیرنده‌های بین غشایی خود متصل شده و منجر به فعال‌سازی آبشارهای سیگنال‌دهی داخل سلولی و سرانجام فعال شدن ژن‌ها می‌شود. گزارش شده که بیان VEGF با پتانسیل متاستاتیک تومورهای پستان ارتباط نزدیکی دارد (23).
طی مطالعه‌ای با طراحی پپتید آنتاگونیست فاکتور رشد اندوتلیال عروقی، مشاهده شد که پپتید VGB4 منجر به اثر ممانعت‌کنندگی معنی‌داری بر رشد تومور کارسینومای پستان شده است (24). افزایش بیان فاکتورهای رشد به تنهایی برای رگ‌زایی شدن سلولهای توموری کافی نیست، بلکه مهارکننده‌ها درون‌زاد رگ‌زا که اندوتلیوم را از اثر عوامل تحریک‌کننده میتوز حفظ می‌کند نیز باید کاهش یابند (25، 26). برای مهار پیشرفت و متاستاز تومور و سلولهای هدف رگ‌زایی‌تراپی روش مناسبی است، از آن‌جایی که این روش مانع از رسیدن مواد غذایی به سلولهای توموری می‌شود، موجبات مرگ این سلول‌ها را فراهم می‌کند (27).
نتیجه‌گیری
پژوهش حاضر در خصوص بیان ژن‌های 10-IL و VEGF در مدل تجربی ایجاد تومور پستان، نشان داد که بیان هر دو ژن در بافت تومور پستان نسبت به سلولهای گروه شاهد بیشتر بود ولیکن این اختلاف معنی‌دار نبود. با توجه به اینکه 10-IL نقش دوگانه در رشد تومور دارد به طوری که از یک طرف باعث سرکوب برخی از پاسخ‌های ایمنی ضد تومور و همچنین ممانعت از القای تشکیل عروق در بافت تومور می‌شود (17) و از طرف دیگر می‌تواند برخی از پاسخ‌های ایمنی ضد تومور را تحریک کند (24). از محدودیت‌های مطالعه حاضر می‌توان به بررسی صرفاً بیان دو ژن مورد مطالعه اشاره کرد و بنابریان تحقیقات و مطالعات بیشتری لازم است تا نقش سیتوکین‌های مختلف و همچنین فاکتورهای رشد عروقی در رشد و توسعه تومور دقیق‌تر مشخص گردد.
تشکر و قدردانی
بدین‌وسیله از تمامی افرادی که در انجام این پژوهش ما را یاری داده‌اند؛ کمال تشکر و قدردانی را داریم.
سهم نویسندگان
طراحی پژوهش: سیما نصری، صمد فراشی بناب انجام پژوهش و آنالیز آماری: رعنا نوروزی کما علیا، نگارش مقاله: فرشته دادفر، ویرایش مقاله: نعیمه دهقانی.
تضاد منافع
هیچگونه تعارض منافع توسط نویسندگان بیان نشده است.
سرطان پستان، یکی از شایع‌ترین انواع سرطان و یکی از مهم‌ترین عوامل مرگ و میر زنان در این رابطه می‌باشد (1). آسیب‌شناسی این بیماری چند فاکتوری است و عوامل مختلفی از جمله عوامل ژنتیکی، سابقه خانوادگی، بالا رفتن سن، عوامل هورمونی، عدم سابقه زایمان یا زایمان اول تا سن
30 سالگی، عوامل محیطی از جمله عوامل تغذیه‌ای و نحوه زندگی و استفاده از بعضی از داروهای هورمونی در ایجاد سرطان پستان به عنوان عوامل خطرزا محسوب می‌شوند، در حال حاضر در کشورهای آسیایی این بیماری به سرعت در حال گسترش است (2، 3).
مطالعات متعدد نشان داده‌اند که تقریباً 25درصد از سرطان‌ها به دلیل التهاب مزمن ناشی از عفونت یا حالت‌های التهابی با منشأهای گوناگون می‌باشد. یکی از عواملی که در گسترش تومور در سرطان پستان نقش ایفا می‌کند، التهاب می‌باشد (4) که می‌تواند منجر به بروز متاستاز، مقاومت نسبت به درمان، رشد تومور، آنژیوژنز و تولید سیتوکین‌ها شود (5). سیتوکین‌ها گلیکوپروتئین‌هایی هستند که توسط سیستم ایمنی تولید می‌شوند و نقش کلیدی را در التهاب ناشی از سرطان ایفا می‌کنند (6، 7).
اینترلوکین-10 یا Interleukin-10 (IL-10) یکی از مهم‌ترین سیتوکین‌های ضدالتهابی و تعدیل‌کننده ایمنی در پاسخ‌های ایمنی است که بر روی کروموزوم 1 قرار گرفته (8) و به وسیله سلولهای ایمنی از قبیل ماکروفاژها، لنفوسیت T و سلولهای NT ساخته می‌شود و یک فاکتور حمایت‌کننده ایمنی و ضد آنژیوژنز است (9). این فاکتور در ارتباط با سرطان پستان به صورت دوسویه عمل می‌کند، از یک طرف افزایش این سیتوکین از طریق فعال‌سازی لنفوسیت‌های T سیستوتوکسیک می‌تواند دارای اثر بازدارندگی در رشد و متاستاز سرطان پستان داشته باشد و می‌تواند رشد تومور را از طریق حمایت از سلولهای تومور در برابر پاسخ‌های ایمنی افزایش دهد و از طرف دیگر به دلیل ویژگی ضد آنژیوژنزی منجر به سرکوب رشد و گسترش تومور می‌گردد و بنابراین بیشتر نقش این سیتوکین، نقش حمایتی است (10).
خانواده فاکتورهای رشد اندوتلیال عروقی یا
(Vascular endothelial growth factor) VEGF شامل یکسری گلیکوپروتئین‌های ترشحی(VEGFA, VEGFB, VEGFC, VEGFD, PLGF) هستند که شباهت‌های بسیاری از نظر ساختاری باهم دارند (11). فاکتور رشد اندوتلیال عروقی (VEGFA) یک از فاکتورهای ترشح شده از بافت توموری است که به عنوان تنظیم‌کننده رگ‌زایی، برای رشد تومور و متاستاز ضروری می‌باشد (12). VEGF-A القاء‌کننده کلیدی توسعه عروق‌زایی از طریق فعال‌سازی گیرنده 2 VEGF می‌باشد (13). همچنین احتمالاً مهم‌ترین مسیر سیگنالینگ برای رشد عروق تومور است (14). بررسی‌های متعدد نشان داده است که عملکرد VEGF محدود به عروق زایی و نفوذپذیری عروق نیست، به عنوان مثال این ملکول می‌تواند عملکرد سلولهای ایمنی را که در محیط تومور حضور دارند را تحت تأثیر قرار دهد. گیرنده‌هایVEGF ممکن است عملکرد فیبروبلاست‌ها را در استرومای تومور تنظیم کند (15). سیگنالینگVEGF در سلولهای تومور به صورت اتوکرین و پاراکرین انجام می‌شود و این سیگنالینگ در تومورزایی و به خصوص عملکرد سلولهای بنیادی سرطان مستقل از عروق‌زایی نقش دارد (16). در مطالعه حاضر با ایجاد مدل تجربی تومور پستان در موش‌های نژاد بالب/سی، میزان بیان ژن‌های VEGF و10-IL در بافت تومور مورد ارزیابی قرار گرفت.
روش کار
در پژوهش تجربی حاضر 20 سر موش نژاد بالب/سی دوماهه با وزن 25 تا 30 انتخاب و به مدت یک هفته در حیوان‌خانه دانشگاه علوم پزشکی تهران در دمای 22 تا 26 درجه سانتی‌گراد، سیکل روشنایی- تاریکی 12 ساعته و دسترسی آزاد به آب و غذا نگهداری شدند. برای ایجاد سرطان پستان از سلولهای رده توموری اپیتلیال پستان (14T) (ATCC CRL-2539) تهیه شده از انیستتو پاستور تهران استفاده شد. سلولهای توموری پستان در محیط کشت 1640RPMI (اینویتروژن، بریتانیا) حاوی 10 درصد سرم جنین گاو (جیپکو-بریتانیا)، 2 میلی‌مول L-گلوتامین (سیگما، بریتانیا) و آنتی‌بیوتیک‌های پنی‌سیلین (U/ml 100) و استرپتومایسین (μg/ml 100) کشت داده شدند. انکوباسیون سلول‌ها در دمای C°37 انجام شد. قبل از تلقیح تومور، سلول‌ها از نظر آلودگی به مایکوپلاسما توسط کشت میکروبی بررسی شدند. موش‌ها به طور تصادفی به دو گروه شاهد و آزمایشی تقسیم شدند. در گروه شاهد هیچگونه تلقیحی صورت نگرفت و به گروه آزمایشی تومور کشت داده شده تلقیح شد. برای تلقیح تومور، سلول‌ها از فلاسک کشت سلول با تریپسینه کردن جدا شده و پس از شستشو، به تعداد 105×5 به صورت زیرجلدی با رعایت اصول اخلاقی کار با حیوانات آزمایشگاهی، در گروه آزمایشی ضمن بی‌دردی حیوان و مهار موش با زاویه 10 الی 30 درجه با سوزن مناسب با گیج 23 و حجم تزریق 25/0 میلی‌لیتر در تهی‌گاه گروه آزمایشی تزریق شدند. پس از رشد تومورها، با تهیه مقاطع هیستوپاتولوژی بافت تومور تأیید گردید. این تومور از نوع بدخیم بود در مقاطع بافتی نکروز مشاهده شد (شکل 1).
برای تهیـه بافـت تومـوری، پس از بیهوش کردن موش و برش در ناحیه تشکیل تومور، تومور برداشته شد و پـس از جـدا کـردن خـون و بافـت اضـافه، تومور استخراج شد. سه هفته بعد از تلقیح سلولهای توموری و مشاهده رشد تومور، میانگین حجم تومور در هفته سوم
mm3 4/190 بود.
|
الف
|
|
ج
|
|
ب
|
شکل 1. الف- کشت سلولهای توموری پستان، ب- تومور ایجاد شده در تهی‌گاه موش، ج- بافت تومور پستان رشد کرده در تهی‌گاه موش
استخراج mRNAهای بافت تومور: برای بررسی بیان ژن‌های
10-IL و VEGF در مراحل مختلف رشد تومور، mRNA از بافت تومور استخراج شد. بدین منظور پس از القاء تومور، بافت تومور از 10 سر موش در هر گروه جداسازی شد. سپس بافت تومور با استفاده از بافر لیز‌کننده حاوی گوانیدین تیوسیانات (محلول کیازول، آمریکا) متلاشی گردید. پس از افزودن 1 میلی‌لیتر بافر لیز‌کننده و انکوباسیون به مدت ́5 دردمایC250، کلروفرم (ml2/0) اضافه شد و پس از ورتکس، میکروتیوب‌ها به مدت ́10 در دمای C25 انکوبه شدند. با سانتریفیوژ میکروتیوب‌ها (در دور g12000 به مدت ́15 در دمای C40سه فاز تشکیل شد. RNA از فاز رویی شفاف و بی‌رنگ با اضافه کردن ایزوپروپانول (ml5/0) و سپس انکوباسیون به مدت ́10 درC250 و سانتریفیوژ (با دور g12000 به مدت ́10 در دمای C40) رسوب داده شد. رسوب با اتانول (اتیل الکل) %75 (ml1) شسته شده و پس از سانتریفیوژ (در دور g7500 به مدت ́5 در دمای C40) و خشک کردن رسوب (در محیط)؛ RNA درµl 50 آب عاری از RNase حل شد. کیفیت و مقدار RNA به دست آمده با استفاده از نانودراپ (Thermoscientific, USA) با روش اسپکتروفتومتری بررسی شد. در مرحله بعد، هرگونه DNA باقیمانده در RNAهای استخراج شده با تیمار با DNase عاری از RNase (فرمنتاز، آمریکا) حذف گردید.
سنتز cDNA از mRNAهای استخراج شده از سلولهای توموری: سنتز cDNA از روی mRNAهای استخراج شده به روش (RT-PCR) توسط آنزیم رونوشت‌برداری معکوس
(Meloney-murine leukemia virus) M-MuLV (فرمنتاز، آمریکا) و پرایمرهای رندوم هگزامر وOligo dT(18) در حضور (d Nucleoside Triphosphate) dNTP و RNA guard (جدول 1) و با انکوباسیون در دماهای C250 به مدت ́5، C420 به مدت ́60 و C750 به مدت ́5 (در دستگاه ترموسیکلر، Eppendorf/England)
صورت گرفت.
جدول 1. اجزاء مسترمیکس سنتز cDNA از روی mRNAهای استخراج شده از
سلولهای توموری
| Components | Volum/Concentration |
| RNA | 500-100 ng |
| M-MuLV | 75/0 μl(150 Unit) |
| PCR reaction buffer | 3μl |
| RNA guard | 75/0 μl(30Unit) |
| Oligo dT (18) primer Random hexamer |
75/0 μl |
| dNTP | 5/1 μl(10mM) |
| DEPC treated H2o | 75/6μl |
| Total | 15 μl |
Real-time RT-PCR برای بررسی میزان بیان ژن‌های 10-IL و VEGF: برای انجام Real-Time Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction) از مسترمیکس PCR (فرمنتاز-لیتوانی) شامل DNA پلیمراز Taq (Hot start)، dNTP (نوکلئوتیدهای آزاد)، منیزیم کلراید، بافر PCR حاوی کلرید پتاسیم و سولفات آمونیوم، رنگ فلورسنت سایبرگرین I و رنگ رفرانس غیرفعال ROX استفاده گردید و به آن ژن خانه‌دار (Housekeeping gene) با غلظت μM25/0 و cDNA (حدود ng500) اضافه شد (با حجم نهایی محلول واکنش μl15 چرخه‌های حرارتی شامل C950 به مدت ́10 (برای فعال‌سازی آنزیم) و به دنبال آن 45 چرخه در دو مرحله C950 به مدت ˝15 (مرحله واسرشتگی) و C600 به مدت ˝60 (مرحله اتصال-مرحله امتداد) بود که در دستگاه Applied Biosystems مدل StepOne انجام شد. برای بررسی محصول PCR پس از اتمام چرخه‌ها، آنالیز منحنی ذوب برای تأیید محصول انجام شد. پرایمرها با استفاده از نرم‌افزار open primer3source froge USA طراحی شد و با استفاده از سایت اینترنتی /https://www.ncbi.nlm. nih. Gob Blast تایید گردید. توالی پرایمرهای استفاده شده برای تکثیر IL-10 و VEGF به ترتیب زیر بود:
10-IL/F
5'-CGGACTGAGAGGACACAGGTTAC-3'
10-IL/R
VEGF/F
5′-ACCATGCCAACTTCTGTCTG-3′
VEGF/R
5′-CGGGTTGTGTTGGTTGTAGA-3′
تحلیل و تجزیه متغیرهای حاصل از بیان ژن‌های اینترلوکین-10 و فاکتور رشد اندوتلیال عروقی در گروه‌های آزمایشی با استفاده از نرم‌افزار SPSS نسخه 20 (version 20, IBM Corporation, Armonk, NY) و روش آماری T-test انجــام گرفت.
یافته‌ها
ارزیابی محصول PCR و منحنی ذوب بیان ژن‌های 10-IL و VEGF: در مطالعه حاضر کمیت و کیفیت RNAهای استخراج شده با نانودراپ در طول موج های 260، 280 و 230 نانومتر بررسی شد. نسبت جذب نوری 280/260 و 260/230 به ترتیب بین 2-8/1 و 2-5/1 بود که نشان‌دهنده کیفیت مناسب RNAهای استخراج شده بود (شکل 2).
شکل2. بررسی کیفیت و کمیت RNAهای استخراج شده با نانودراپ
پس از اتمام چرخه‌های حرارتی، منحنی ذوب مربوط به ژن‌های 10-IL و VEGF توسط دستگاه ثبت شد. برای کشیدن منحنی ذوب، دمای میکروتیوب‌ها به °C65 رسانده شد و تا °C95 افزایش یافت. این افزایش دما به ازای هر 3/0 دقیقه به میزان °C3/0 بود و میزان فلورسنس طی هر بار افزایش دما اندازه‌گیری شد و به صورت گراف ترسیم شد. همچنین تک قله‌ای بودن منحنی ذوب حاکی از عملکرد بهینه پرایمرها برای انجام واکنش RT-PCR برای ژن‌های 10-IL و VEGF بود (شکل 3).
شکل 3. منحنی ذوب مربوط به بیان ژن‌های 10-IL و VEGF پس از انجام RT-PCR
نتایج مربوط به بیان ژن‌های 10-IL و VEGF در دو گروه آزمایشی: آنالیز داده‌های حاصل از بیان ژن‌های 10-IL و VEGF نشان داد که بیان ژن 10-IL در بافت تومور نسبت به سلولهای گروه شاهد 7/4 برابر و بیان ژن VEGF 6/5 برابر نسبت به سلولهای گروه شاهد بیشتر بوده است (نمودار 1) ولی این افزایش بیان در گروه آزمایش در مقایسه با گروه شاهد از نظر آماری معنی‌دار نبود (05/0 < P).
بحث
پژوهش‌های پیشین نشان داده‌اند که اینترلوکین-10 یک سیتوکین چند عملکردی می‌باشد که نقش تعدیل‌کننده در پاسخ‌های لنفوئیدی و میلوئیدی ایفا می‌کند (17). 10-IL تولید شده توسط ماکروفاژهای وابسته به تومور در سرکوب فعالیت ضد توموری در لنفوم غیر هوچکین نیز نقش دارد (18).
نمودار 1. بررسی سطح بیان ژن‌های 10-IL و VEGF در بافت تومور پستان نسبت به گروه شاهد
افزایش بیان 10-IL در انواع مختلف سرطان انسانی مثل سرطان دهانه رحم، کولورکتال، کلیه، سرطان هپاتوسلولار و تخمدان و همچنین سرطان سلولهای سنگفرشی، سلولهای بازال پوست و گلیومای انسانی و ملانوما گزارش شده است اینترلوکین-10 در مختل کردن پاسخ ایمنی از طریق کاهش بیان (Human LeukocyAntigen I) HLA-Iو یا افزایش بیان HLA-G در تروفوبلاست انسان و مونوسیت و همچنین انواع خاصی از سرطان مثل سرطان ریه دخالت داشته است (19). به طور کلی عملکرد بیولوژیکی دوگانه 10-IL به عنوان عامل ضد التهابی (گسترش دهنده سرطان) و ضد رگ‌زایی (مهار‌کننده تومور) نشان‌دهنده اطلاعات متناقض در سرطان می‌باشد (20، 21). مطالعات Li و همکاران نشان داد که دو پلی‌مورفیسم rs1800896 و rs1800872 ژن اینترلوکین-10 به طور معنی‌داری منجر به افزایش ریسک ابتلا به سرطان پستان در بین آسیایی‌ها می‌گردد و بنابراین این پلی‌مورفیسم‌های ژن
IL-10 یک تنظیم‌کننده کلیدی در سرطان پستان می‌باشند (8).
IL-18در سرطان پستان به شدت بیان می‌شود و ارتباط مثبتی با
IL-10 دارد. هر دو IL-18 و 10-IL ممکن است ارتباط مثبتی با متاستاز به غدد لنفاوی در سرطان پستان داشته باشند (22). همچنین به نظر می‌رسد آگونیست‌ها و آنتاگونیست‌های IL-10 ممکن است از طریق مکانیسم‌های مختلف اثرات درمانی داشته باشند. علاوه بر این، پلی‌مورفیسم‌های ژن IL-10 ممکن است استعداد ابتلا به سرطان سینه را تعیین کند (9).
VEGF یک فاکتور ترشحی است که به گیرنده‌های بین غشایی خود متصل شده و منجر به فعال‌سازی آبشارهای سیگنال‌دهی داخل سلولی و سرانجام فعال شدن ژن‌ها می‌شود. گزارش شده که بیان VEGF با پتانسیل متاستاتیک تومورهای پستان ارتباط نزدیکی دارد (23).
طی مطالعه‌ای با طراحی پپتید آنتاگونیست فاکتور رشد اندوتلیال عروقی، مشاهده شد که پپتید VGB4 منجر به اثر ممانعت‌کنندگی معنی‌داری بر رشد تومور کارسینومای پستان شده است (24). افزایش بیان فاکتورهای رشد به تنهایی برای رگ‌زایی شدن سلولهای توموری کافی نیست، بلکه مهارکننده‌ها درون‌زاد رگ‌زا که اندوتلیوم را از اثر عوامل تحریک‌کننده میتوز حفظ می‌کند نیز باید کاهش یابند (25، 26). برای مهار پیشرفت و متاستاز تومور و سلولهای هدف رگ‌زایی‌تراپی روش مناسبی است، از آن‌جایی که این روش مانع از رسیدن مواد غذایی به سلولهای توموری می‌شود، موجبات مرگ این سلول‌ها را فراهم می‌کند (27).
نتیجه‌گیری
پژوهش حاضر در خصوص بیان ژن‌های 10-IL و VEGF در مدل تجربی ایجاد تومور پستان، نشان داد که بیان هر دو ژن در بافت تومور پستان نسبت به سلولهای گروه شاهد بیشتر بود ولیکن این اختلاف معنی‌دار نبود. با توجه به اینکه 10-IL نقش دوگانه در رشد تومور دارد به طوری که از یک طرف باعث سرکوب برخی از پاسخ‌های ایمنی ضد تومور و همچنین ممانعت از القای تشکیل عروق در بافت تومور می‌شود (17) و از طرف دیگر می‌تواند برخی از پاسخ‌های ایمنی ضد تومور را تحریک کند (24). از محدودیت‌های مطالعه حاضر می‌توان به بررسی صرفاً بیان دو ژن مورد مطالعه اشاره کرد و بنابریان تحقیقات و مطالعات بیشتری لازم است تا نقش سیتوکین‌های مختلف و همچنین فاکتورهای رشد عروقی در رشد و توسعه تومور دقیق‌تر مشخص گردد.
تشکر و قدردانی
بدین‌وسیله از تمامی افرادی که در انجام این پژوهش ما را یاری داده‌اند؛ کمال تشکر و قدردانی را داریم.
سهم نویسندگان
طراحی پژوهش: سیما نصری، صمد فراشی بناب انجام پژوهش و آنالیز آماری: رعنا نوروزی کما علیا، نگارش مقاله: فرشته دادفر، ویرایش مقاله: نعیمه دهقانی.
تضاد منافع
هیچگونه تعارض منافع توسط نویسندگان بیان نشده است.
فهرست منابع
1. Anastasiadi Z, Lianos GD, Ignatiadou E, Harissis HV, Mitsis M. Breast Cancer in Young Women: An Overview. Updates Surg. 2017;69:313-7. pmid: 28260181 doi: 10.1007/s13304-017-0424-1
2. Mubarik S, Wang F, Fawad M, Wang Y, Ahmad I, Yu C. Trends and projections in breast cancer mortality among four Asian Countries (1990-2017): evidence from five stochastic mortality models. Sci Rep. 2020;10:5480. pmid: 32214176 doi: 10.1038/s41598-020-62393-1
3. Oblak T, Zadnik V, Krajc M, Lokar K, Zgajnar J. Breast cancer risk based on adapted ibis prediction model in slovenian women aged 40- 49 years - could it be better? Radiol. Oncol. 2020;54:335–40. pmid: 32614783 doi: 10.2478/raon-2020-0040
4. Mohamed H.T, El-Husseiny N, El-Ghonaimy E.A, Ibrahim S.A, et al. IL-10 Correlates with the Expression of Carboxypeptidase B2 and Lymphovascular Invasion in Inflammatory Breast Cancer: The Potential Role of Tumor Infiltrated Macrophages. Curr Probl Cancer. 2018;42(2):215–30. pmid: 29459177 doi: 10.1016/j.currproblcancer.2018.01.009
5. Carpi A, Nicolini A, Antonelli A, Ferrari P and Rossi G. Cytokines in the management of high risk or advanced breast cancer: an update and expectation. Curr. Cancer Drug Targets. 2009;9(8):888-903. pmid: 20025599 doi: 10.2174/156800909790192392
6. Korkaya H, Liu S, Wicha MS. Breast cancer stem cells, cytokine networks, and the tumor microenvironment. J Clin Invest. 2011;121(10):3804-9. pmid: 21965337 doi: 10.1172/JCI57099
7. Vacchelli E, Aranda F, Obrist F, Eggermont A, Galon J, Cremer I, et al. Trial watch: immunostimulatory cytokines in cancer therapy. Oncoimmunology. 2014;3(6):290-94. pmid: 25083328 doi: 10.4161/onci.29030
8. Li L, Xiong W, Li D, Cao J. Association of Interleukin-10 Polymorphism (rs1800896, rs1800871, and rs1800872) With Breast Cancer Risk: An Updated Meta-Analysis Based on Different Ethnic Groups. Front. Genet. 2022;13:829283. pmid: 35186043 doi: 10.3389/fgene.2022.829283
9. Sheikhpour E, Noorbakhsh P, Foroughi E, et al. A survey on the role of interleukin-10 in breast cancer: a narrative. Rep Biochem Mol Biol. 2018;7(1):30-7. pmid: 30324115
10. Pournemati P, Hooshmand Moghadam. The effect of 12 weeks of interval and continuous training on serum levels of interleukin-17 and interleukin-10 in postmenopausal breast cancer survivors: a clinical trial [in Persian]. Iranian Journal of Breast Diseases. 2021;14(2):4-15. doi: 10.30699/ijbd.14.2.4
11. Ferrara N. VEGF and the quest for tumor angiogenesis factors. Nature Reviews Cancer 2002;2(10): 795-803. pmid: 12360282 doi: 10.1038/nrc909
12. .Shibuya M. Vascular endothelial growth factor receptor-1 (VEGFR-1/Flt-1): a dual regulator for angiogenesis. Angiogenesis. 2006;9(4):225-30. pmid: 17109193 doi: 10.1007/s10456-006-9055-8
13. Koch S, Claesson-Welsh L. Signal transduction by vascular endothelial growth factor receptors. Cold Spring Harb Perspect Med. 2012;2(7):a006502. pmid: 22762016 doi: 10.1101/cshperspect.a006502
14. Senger DR. Vascular endothelial growth factor: much more than an angiogenesis factor. Mol Biol Cell. 2010; 21(3):377-9. pmid: 20124007 doi: 10.1091/mbc.E09-07-0591
15. Yaqoob U, Cao S, Shergill U, Jagavelu K, et al. Neuropilin-1 stimulates tumor growth by increasing fibronectin fibril assembly in the tumor microenvironment. Cancer Res. 2012;72(16):4047-59. pmid: 22738912 doi: 10.1158/0008-
16. CAN-11-3907
17. Goel H.L, Mercurio A.M. VEGF targets the tumor cell. Nat Rev Cancer.2013; 13(12):871-882.
18. Berti FCB, de Oliveira KB. IL-10 in cancer: Just a classical immunosuppressive factor or also an immunostimulant one? AIMS Allergy and Immunology. 2018; 2(2):88-97. doi: 10.3934/Allergy.2018.2.88
19. Garcia-Hernández ML, Hernandez-Pando R, Gariglio P, Berumen J. Interleukin-10 promotes B16-melanoma growth by inhibition of macrophage functions and induction of tumour and vascular cell proliferation. Immunology. 2002; 105(2):231–43. pmid: 11872099 doi: 10.1046/j.1365-2567.2002.01363.x
20. Hedrich CM, Bream JH. Cell type-specific regulation of IL-10 expression in inflammation and disease. Immunol Res. 2010;47(1-3):185-206. pmid: 20087682 doi: 10.1007/s12026-009-8150-5
21. Segal BM, Glass DD, Shevach EM. Cutting Edge: IL- 10-producing CD4+ T cells mediate tumor rejection. J Immunol. 2002;168(1):1-4. pmid: 11751938 doi: 10.4049/jimmunol.168.1.1
22. Kohno T, Mizukami H, Suzuki M, Saga Y, Takei Y, Shimpo M, et al. Interleukin-10-mediated inhibition of angiogenesis and tumor growth in mice bearing VEGF-producing ovarian cancer. Cancer Res. 2003;63(16):5091-4. pmid: 12941839
23. Ma T, Kong M. Interleukin 18 and 10 may be associated with lymph node metastasis in breast cancer. Oncol Lett. 2021;21(4):253. pmid: 33664817 doi: 10.3892/ol.2021.12515
24. Bolat F, Kayaselcuk F, Nursal TZ, Yagmurdur MC, Bal N, Demirhan B. Microvessel density, VEGF expression, and tumor-associated macrophages in breast tumors: correlations with prognostic parameters. J Exp Clin Cancer Res. 2006;25(3):365-72. pmid: 17167977
25. Farzaneh Behelgardi M, Zahri S, Mashayekhi F, Asghari SM. The effect of vascular endothelial growth factor antagonist peptide (VGB4) on breast tumor growth suppression in vivo [in Persian]. Armaghane-Danesh. 2019;23(6):683-93.
26. Ricci-Vitiani L, Pallini R, Biffoni M. Tumour vas-cularization via endothelial differentiation of glioblastoma stem-like cells. Nature. 2010; 468(7325):824–8. pmid: 21102434 doi: 10.1038/nature09557
27. de Laporte L, des Rieux A, Tuinstra HM, Zelivyanskaya ML, De Clerck NM, Postnov AA, et al. Vascular endothelial growth factor and fibroblast growth factor 2 delivery from spinal cord bridges to enhance angiogenesis following injury. J Biomed Mater Res A. 2011;98(3):372–82. pmid: 21630429 DOI: 10.1002/jbm.a.33112
28. Ramezani T, Baharaa J. A review on angiogenesis in tumor [in Persian]. Journal of Cell & Tissue. 2014;5(1):89-100. doi: 10.52547/JCT.5.1.89
ارسال پیام به نویسنده مسئول
| بازنشر اطلاعات | |
 |
این مقاله تحت شرایط Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License قابل بازنشر است. |
