fa کلونینگ، بیان و تخلیص پروتئین نوترکیب فیوژن Tat-Nef ویروس HIV-1 در سیستم بیانی پروکاریوتی عمومى General پژوهشي اصیل Original Atricle <p dir="RTL" style="margin-right: 28.9pt; text-align: justify;"><strong>زمینه و هدف:</strong> یکی از پروتئین‌های مهم ویروس <span dir="LTR">HIV-1</span> به نام <span dir="LTR">Nef</span> نقش مهمی در چرخه تکثیر ویروس و پیشرفت بیماری ایدز دارد و القای پاسخ ایمنی بر ضد آن می‌تواند تا حدی عفونت ویروسی را مهار نماید. به علاوه، بخشی از ناحیه پروتئین فعال کننده رونویسی (<span dir="LTR">Tat</span>، اسید آمینه‌های 48 تا 60) از ویروس <span dir="LTR">HIV</span> توانسته است به عنوان یک پپتید نفوذ کننده سلولی (<span dir="LTR">CPP</span>) عمل نماید. در این تحقیق، برای اولین بار کلونینگ و بیان فیوژن <span dir="LTR">Tat-Nef</span> در باکتری اشرشیاکلی صورت گرفت. تأیید بیان پروتئین توسط آنالیز وسترن بلات و تخلیص آن از طریق روش رنگ آمیزی معکوس انجام شد.</p> <p dir="RTL" style="margin-right: 28.9pt; text-align: justify;"><strong>مواد و روش</strong>‌<strong>ها:</strong> در این مطالعه تجربی، ابتدا کلونینگ فیوژن <span dir="LTR">Tat-Nef</span> در وکتور بیانی <span dir="LTR">pGEX6p2</span> صورت گرفت. سپس القای بیان پروتئین نوترکیب <span dir="LTR">Tat-Nef</span> در باکتری اشرشیا کلی سویه <span dir="LTR">BL21 (DE3)</span> توسط القا کننده <span dir="LTR">IPTG</span> انجام شد. تأیید بیان از طریق تکنیک <span dir="LTR">SDS-PAGE</span> و وسترن بلات با استفاده از آنتی‌بادی منوکلونال ضد <span dir="LTR">Nef</span> صورت گرفت. سپس، تخلیص پروتئین فیوژن توسط تکنیک رنگ آمیزی معکوس از روی ژل انجام شد.</p> <p dir="RTL" style="margin-right: 28.9pt; text-align: justify;"><strong>یافته</strong>‌<strong>ها:</strong> نتایج آنالیز <span dir="LTR">PCR</span> و هضم آنزیمی، وجود باند واضح حدود 726 جفت باز را روی ژل آگارز تأیید کرد که نشان‌گر کلونینگ صحیح فیوژن <span dir="LTR">Tat-Nef</span> در وکتور بیان پروکاریوتی <span dir="LTR">pGEX6p2</span> بود. هم‌چنین، وجود باند پروتئینی حدود 54 کیلودالتون روی ژل <span dir="LTR">SDS-PAGE</span> نشان‌گر بیان پروتئین <span dir="LTR">Tat-Nef</span> بود که توسط آنتی‌بادی منوکلونال ضد <span dir="LTR">Nef</span> در آنالیز وسترن بلات تأیید شد.</p> <p style="text-align: justify; margin-right: 40px;"><span dir="RTL">&nbsp;</span><strong><span dir="RTL">نتیجه</span></strong><span dir="RTL">‌</span><strong><span dir="RTL">گیری:</span></strong><span dir="RTL"> پروتئین فیوژن نوترکیبTat-Nef </span><span dir="RTL">تخلیص شده به عنوان یک آنتی ژن برای طراحی واکسن پروتئینی در مقابل&nbsp; </span><span dir="RTL">عفونت ویروس</span><span dir="RTL"> HIV استفاده خواهد شد.</span></p> <p style="text-align: justify"><strong><em>Background:</em></strong> Nef is one of the HIV-1 critical proteins, because it is essential for viral replication and AIDS disease progression and induction of immune response against it can partially inhibit viral infection. Moreover, a domain of the HIV-1 Trans-Activator of Transcription (Tat, 48-60 aa) could act as a cell penetrating peptide (CPP). In current study, cloning and expression of Tat-Nef fusion protein was performed in <em>E.</em> <em>coli</em> for the first time. The protein expression was confirmed by western blot analysis and was purified using reverse staining method.</p> <p style="text-align: justify"><strong><em>Materials and Methods:</em></strong> In this experimental study, primarily, cloning of Tat-Nef fusion gene was done in pGEX6p2 expression vector. Then, the expression of Tat-Nef recombinat protein in <em>E.coli</em> BL21 (DE3) strain was performed by using IPTG inducer. The protein expression was confirmed by SDS-PAGE and western blotting using anti-Nef monoclonal antibody. Then, the recombinant fusion protein was purified from gel using reverse staining method.</p> <p style="text-align: justify"><strong><em>Results:</em></strong> The results of PCR analysis and enzyme digestion showed a clear band of ~ 726 bp in agarose gel indicating the correct Tat-Nef fusion cloning in pGEX6p2 prokaryotic expression vector. In addition, a 54 kDa band of Tat-Nef on SDS-PAGE revealed Tat-Nef protein expression that western blot analysis using anti-Nef monoclonal antibody confirmed it.</p> <p style="text-align: justify"><strong><em>Conclusion:</em></strong> The purified Tat-Nef recombinant fusion protein will be used as an antigen for protein vaccine design against HIV infection.</p> ویروس HIV, Nef, Tat, پروتئین نوترکیب, باکتری اشرشیاکلی, واکسن HIV virus, Nef, Tat, Recombinant protein, E. coli, Vaccine 60 68 http://jams.arakmu.ac.ir/browse.php?a_code=A-10-4144-1&slc_lang=fa&sid=1 Somayeh Kadkhodayan سمیه کدخدایان 4600319475328460064016 4600319475328460064016 No Department of Biology, Sciences and Research Branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran. گروه زیست شناسی، واحد علوم و تحقیقات، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران. Shiva Irani شیوا ایرانی 4600319475328460064017 4600319475328460064017 No Department of Biology, Science and Research Branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran گروه زیست شناسی، واحد علوم و تحقیقات، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران. Seyed Mehdi Sadat سید مهدی سادات 4600319475328460064018 4600319475328460064018 No Department of Hepatitis and AIDS, Pasteur Institute of Iran, Tehran, Iran. بخش هپاتیت و ایدز، انستیتو پاستور ایران، تهران، ایران. Fatemeh Fotouhi فاطمه فتوحی 4600319475328460064019 4600319475328460064019 No Influenza Research Lab., Department of Virology, Pasteur Institute of Iran, Tehran, Iran. آزمایشگاه تحقیقاتی آنفلوانزا، بخش ویروس شناسی، انستیتو پاستور ایران، تهران، ایران. Azam Bolhassani اعظم بوالحسنی A_bolhasani@pasteur.ac.ir 4600319475328460064020 4600319475328460064020 Yes Department of Hepatitis and AIDS, Pasteur Institute of Iran, Tehran, Iran. بخش هپاتیت و ایدز، انستیتو پاستور ایران، تهران، ایران.