فاطمه فقیهی، جعفر امانی هارونی، میلاد غلامی، ایمان سلحشوری فر،
دوره 29، شماره 1 - ( 1-1405 )
چکیده
مقدمه: اختلال طیف اوتیسم (Autism Spectrum Disorder) ASD و اختلال کمبود CDKL5 از جمله اختلالات عصبی- رشدی با ریشه ژنتیکی هستند که نیازمند مدلهای دقیق مولکولی برای مطالعه مکانیسمهای بیماری و توسعه درمانهای نوین میباشند. سیستم ویرایش ژنوم CRISPR/Cas9 ابزاری کارآمد برای ایجاد تغییرات هدفمند در ژنوم است. هدف این مطالعه، طراحی و ساخت وکتور CRISPR/Cas9 حامل sgRNA اختصاصی برای ژن CDKL5و تأیید کلونینگ و هویت خط سلولی مورد استفاده به کمک روشهای مولکولی بود.
روش کار: در این مطالعه تجربی، ابتدا sgRNA اختصاصی برای ناحیه مورد نظر در ژن CDKL5 طراحی شد. الیگوهای Forward و Reverse آنیل شده و در وکتور PX458 کلون شدند. پس از ترانسفورماسیون باکتری E. coli سویه DH5α، کلونیهای مثبت به روش Colony PCR و توالییابی تأیید شدند. همچنین جهت اطمینان از هویت خط سلولی HEK293T مورد استفاده، آزمون QF-PCR برای تعیین جنسیت و بررسی کروموزومی انجام شد.
یافتهها: نتایج Colony PCR وجود باند مورد انتظار 230 جفت بازی را در کلونیهای منتخب نشان داد. توالییابی نیز Insert صحیح sgRNA را در وکتور تأیید کرد. نتایج QF-PCRالگوهای پیکهای مشخص برای کروموزومهای جنسی را نشان داد که هویت خط سلولی را تأیید میکرد.
نتیجهگیری: ساخت وکتور CRISPR/Cas9هدفمند ژن CDKL5با موفقیت انجام شد و تأییدیههای مولکولی لازم شامل کلونینگ و بررسی خط سلولی حاصل گردید. این وکتور میتواند برای مطالعات بعدی ویرایش ژن در مدلهای سلولی مورد استفاده قرار گیرد.
