مقدمه
آمیب‌های آزادزی تک‌یاخته‌هایی هستند که در طبیعت بسیار زیاد وجود دارند. رده‌ها و راسته‌های زیادی از آمیب‌هـا بـا زنـدگی آزاد وجود دارد که جنس‌ها و گونه‌های فراوانی دارند. محل زندگی این آمیب‌ها در آب‌هـای شـیرین، آب‌های شور، خاک و گیاهان در حال فساد است [1]. وفـور و پراکنـدگی آمیب‌هـای آزادزی در طبیعـت اهمیت زیادی دارد، زیرا بعـضی از گونه‌های این آمیب‌ها بیمـاری‌هـای وخـیم و گـاه بـسیار کـشنده در انسان و حیوانات ایجاد می‌کنند. بین جنس‌های متنوع آمیب‌های آزادزی که در طبیعت وجود دارند، اعضای 4 جنس (نگلریا، آکانتامبا، بالاموثیا و ساپینیا) با بیماری‌های انسانی در ارتباط هستند. این جنس‌ها عامل ایجادکننده بیماری‌هایی نظیر انسفالیت و کراتیت هستند [2، 3]. کشندگی بالای این بیماری سبب شده که محققان همواره به ‌دنبال راهی برای مبارزه با آمیب‌های آزادزی باشند. از گذشته تا به امروز از گیاهان و ترکیبات مختلف گیاهی به ‌عنوان یکی از روش‌های مبارزه با انواع تک‌یاخته‌ها استفاده می‌شده است [4]. 
گیاهان متنوعی برای مبارزه با آمیب‌های آزادزی مورد تحقیق قرار گرفته که هر‌کدام با توجه ‌به نوع گیاه، طیف متفاوتی از تأثیر کشندگی بر این تک‌یاخته‌ها داشته است [5-7]. از گیاهانی که تأثیرات تک‌یاخته‌کشی و میکروب‌کشی آن هم به اثبات رسیده، گیاهان لعل کوهستان و اسپند کوهستان هستند. گیاه لعل کوهستان گیاهی بوته‌‌ای است که ‌معمولاً در مناطق جنوبی ایران یافت می‌شود [8، 9]. این گیاه از ترکیباتی شامل تیمول، کارواکرول، پاراسیمن و گاما-ترپینن بود. اسپند گیاهی علفی، پایا و بوته‌ای است که ارتفاع آن تا 50 سانتی‌متر می‌رسد. گیاه اسپند در بیشتر نقاط یافت می‌شود [8]. 
دانه‌های خشک اسپند حاوی پروتئین، روغن و آلکالوئیدهایی مانند هارمالین، هارمین، هارمان، هارمالول، پگانین، ایزوپگانین، دیپگانین، وازیسینن و داوکسی وازینون است. تحقیقات مختلف نشان داد اسپند اثرات مختلفی، ازجمله سقط‌کننده، آمیب‌کش، تقویت‌کننده قوای جنسی، ادرارآور، تهوع‌آور و کرم‌کش دارد [10، 11]. کشندگی بالای این انگل سبب شده که محققان سراسر دنیا به ‌دنبال روش مناسبی برای کشتن و مبارزه با این انگل باشند. اخیراً تحقیق روی گیاهانی مانند لعل کوهستان و اسپند کوهستان که اثر میکروب‌کشی آن‌ها اثبات شده، افزایش یافته است؛ بنابراین بر آن شدیم با طراحی مطالعه اثرات ضدآکانتامبای عصاره الکلی گیاه اسپند کوهستان را بررسی کنیم. 

مواد و روش‌ها
آماده کردن عصاره‌ها
ابتدا گیاهان لعل و اسپند کوهستان از مناطق جنوبی کشور جمع‌آوری و در شرایط مناسب و دور از آفتاب خشک شد. سپس با استفاده از آسیاب برقـی، گـل‌هـای گیاهان را به‌ صورت پودر در‌آمد و برای تهیـه عصـاره از روش پرکولاسیون استفاده شد. در این روش، 50 گرم از پودر گیاهان حاصل درون ظرف دستگاه پرکولاسیون ریخته می‌شد. سپس به پـودر موجود هیدروالکل 70 درصد اضافه و به ‌مدت 72 سـاعت در دمای آزمایشگاه نگهداری می‌شد. بعد از گذشت 72 ساعت، شـیر دستگاه پرکولاتور را باز کـرده و قطـره ‌قطـره عصـاره‌های مورد نظر جمـع‌آوری شد. آن‌گاه عصاره‌های بـه‌دسـت‌آمده را با دستگاه روتاری یا بن‌مـاری در حـرارت 40 تا 50 درجه سلسیوس تغلیظ کرده، در ادامه برای آنکه عصـاره‌ها کاملاً خشک شود، به‌ مدت 24 ساعت در دسـتگاه دسـیکاتور قرار داده می‌شد. در مرحله بعد، مقادیر مورد نظر از هرکدام از عصاره‌های خشـک‌شده در آب مقطر حل می‌شد تا غلظت‌های مختلف بـه‌ دسـت آیـد [12].
آماده کردن تروفوزوئیت‌ها و کیست‌ها
آمیب‌های‌ آزادزی آکانتامبا روی پلیت‌های آگار غیرمغذی در 26 درجه سانتی‌گراد همراه با اشرشیا کلی کشت داده شد. بعد از تقریباً 3 هفته آمیب‌ها با محلول نرمال سالین استریل 2 بار شست‌وشو داده شد. سپس با کمک سانتریفیوژ به ‌مدت 5 دقیقه با دور 1500، 2 بار سانتریفیوژ انجام شد. با استفاده از رنگ تریپان‌بلو و لام‌نئوبار تروفوزوئیت‌ها و کیست‌ها شمارش شد و با غلظت نهایی 104×15 کیست در میلی‌لیتر آزمایش انجام شد.
تعیین فعالیت ضدآمیبی
به ‌منظور ارزیابی فعالیت ضدآمیبی عصاره الکلی اسپند بر انگل آکانتامبا ‌در شرایط کاملاً استریل و زیر هود با استفاده از سمپلر، 100 میکرولیتر از سوسپانسیون انگل، درون میکرو‌تیوپ‌های 1/5 میلی‌لیتری ریخته شد. سپس ابتدا 100 میکرولیتر از هر عصاره به ‌صورت مجزا و سپس به ‌صورت ترکیبی از هر 2 گیاه تهیه شده و در غلظت‌های مختلف عصاره‌ها که به ‌صورت 1/25، 2/5، 5، 10 و 20 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر تهیه شده بود و به ‌صورت مجزا به میکروتیوپ‌های حاوی تک‌یاخته اضافه می‌شد [13]. درنهایت، در انکوباتور 30 درجه سانتی‌گراد قرارداد می‌شد. تأثیر عصاره‌ها در رقت‌های مختلف در 3 زمان 24، 48 و 72 ساعت با استفاده از لام‌نئوبار بررسی شد و با استفاده از فرمول چگنی و همکاران درصد حیات تک‌یاخته‌ها مشخص می‌شد [12]. در این مطالعه از آب مقطر به‌ عنوان گروه کنترل در تمام مراحل استفاده شد. 



داده‌های ﺟﻤﻊآوریﺷﺪه با استفاده از نسخه 21 نرم‌افزار SPSS و آزﻣﻮن‌های آﻣﺎری توصیفی (تعیین درصد) و کای‌دو، ﺑﺎ ﺳﻄﺢ اﻃﻤﯿﻨﺎن‌ P<0/05 ﺳﻨﺠیده شد.

یافته‌ها
برای بررسی اثربخشی عصاره الکلی گیاهان لعل و اسپند کوهستان بر تروفوزوئیت‌ها و کیست‌های آکانتامبا، غلظت‌های 1/25، 2/5، 10 و 20 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر از عصاره‌ها تهیه شد و بعد از 24، 48 و 72 ساعت از تأثیر عصاره‌ها بر تروفوزوئیت‌ها و کیست‌های آکانتامبا و با استفاده از رنگ تریپان بلو، تعداد تروفوزوئیت‌ها (جدول شماره 1) و کیست‌های زنده (جدول شماره 2) شمارش شد. 






همان‌طور که ‌مشاهده شد نتایج بیانگر تأثیر کشندگی عصاره‌های لعل و اسپند کوهستان بر تروفوزوئیت‌ها و کیست‌های آکانتامبا دارد و اثر کشندگی عصاره‌ها با غلظت و مدت‌زمان تأثیر رابطه مستقیم دارد، به نحوی که هرچه غلطت و زمان افزایش یافت، میزان آمیب‌ها کمتر شد و تفاوت معنادار داشت (0/05>P). همچنین نتایج حاکی از تأثیر بیشتر عصاره لعل کوهستان و اثر هم‌افزایی این 2 عصاره بر یکدیگر داشت. 



بحث
کشندگی بالای آمیب‌های آزادزی، به ‌خصوص آکانتامبا سبب اهمیت ویژه این آمیب ‌شده و همواره یکی از دغدغه‌های محققان این بوده که به ‌دنبال روش یا داروی مناسب برای درمان و جلوگیری از کشندگی بیماری‌های ناشی از آکانتامبا باشند [14]. تحقیقات زیادی در سراسر جهان برای یافتن روش مناسبی برای پیشگیری از این بیماری انجام شده وگیاهان دارویی همواره روش مناسبی برای پیشگیری و درمان بیماری‌ها محسوب می‌شوند [5، 15]. 
مطالعات اخیر نشان داد ترکیبات طبیعی خواص ضدانگلی بالا و سمیّت خیلی کمی دارند. محققان از انواع گیاهان دارویی مانند نعناع، پونه، اسپند و گندواش برای درمان بیماری‌های ناشی از آمیب آکانتامبا استفاده کرده‌ا‌ند و نتایج حاصل نیز مؤثر گزارش شده است [16، 17]. در بررسی اثر اسانس گیاهان آویشن، نعناع، پونه و عصاره هیدروالکلی گل راعی روی کیست انگل آکانتامبا در شرایط آزمایشگاهی که توسط شبستری و همکاران انجام شد، مقایسه میزان مرگ‌ومیر انگل بین گروه کنترل و تست نشان داد مرگ‌ومیر کیست‌های آکانتامبا در گروه تست که در معرض فرآورده گیاهی بودند، بیشتر بود. اسانس آویشن و نعناع در غلظت یکسان 10 درصد و زمان 24 ساعت، به ‌ترتیب بیشترین (22 درصد) و کمترین (4 درصد) مرگ‌ومیر را ایجاد کردند. نتایج نشان داد میزان مرگ‌ومیر آکانتامبا وابسته به زمان بوده است. این مسئله بیانگر مؤثر بودن این گیاهان در کشندگی آمیب آکانتامبا است که با نتایج این مطالعه و تأثیر کشندگی عصاره الکلی گیاه لعل کوهستان و اسپند هم‌خوانی داشت [18].
در مطالعه دیگر، نیری و همکاران به بررسی تأثیر آرتمیزینین و عصاره الکلی و آبی گندواش روی ژنوتایپ T4 آکانتامبا در شرایط برون‌تنی پرداختند. آن‌ها نشان دادند غلظت‌های مختلف عصاره آرتمیزیا آنووا فعالیت ضد‌آکانتامبایی دارد و در حضور 10 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر عصاره الکلی در محیط کشت پس از 72 ساعت، 51/30/0تروفوزوئیت‌ها زنده بودند. 
همچنین‌ در حضور 10 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر عصاره آبی گندواش در محیط کشت، پس از 72 ساعت 0/58/25 از تروفوزوئیت‌ها زنده بودند که با نتایج این مطالعه و تأثیر کشندگی عصاره الکلی اسپند هم‌خوانی داشت. با توجه ‌به اینکه درصد کشندگی با گیاه اسپند بیشتر بوده، می‌توان گفت که تأثیر کشندگی عصاره الکلی گیاه اسپند از عصاره گنداوش بیشتر بوده است [12]. 
در ادامه این مطالعه، نیری و همکاران به بررسی عصاره آبی اسپند پرداختند. آن‌ها گزارش کردند که عصاره آبی اسپند دارای فعالیت ضدآمیبی وابسته به دُز و زمان روی تروفوزوئیت‌ها و کیست‌هاست و در حضور 10 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر عصاره آبی اسپند در محیط کشت پس از 72 ساعت، 0/32/47 از تروفوزوئیت‌ها و 0/15/50 از کیست‌ها زنده بود [12، 19] که با نتایج این مطالعه کاملاً هم‌خوانی داشت. نکته‌ لازم به ذکر در این مطالعه، فعالیت ضد‌آمیبی عصاره الکلی اسپند وابسته به زمان و دُز بود و با افزایش دُز و زمان، اثر عصاره بیشتر می‌شد. با وجود نتایج به‌دست‌آمده می‌توان گفت که عصاره الکلی گیاه لعل کوهستان اثر آمیب‌کشی بیشتر از عصاره گیاه اسپند کوهستان دارد. همچنین این 2 گیاه اثر هم‌افزایی بر یکدیگر داشتند.

نتیجه‌گیری
با توجه ‌به نتایج به‌دست‌آمده می‌توان گفت گیاه لعل کوهستان و گیاه اسپند تأثیر کشندگی خوبی بر آمیب آکانتامبا دارند و اگر با هم استفاده شوند، اثر کشندگی یکدیگر را افزایش می‌دهند.

ملاحظات اخلاقی

پیروی از اصول اخلاق پژوهش
کمیته اخلاق دانشگاه علوم‌پزشکی جهرم این مطالعه را با شماره (IR.JUMS.REC.1398.029) تأیید کرده است. 

حامی مالی
دانشگاه علوم پزشکی‌جهرم، حامی مالی این پروژه است.

مشارکت نویسندگان
تمام نویسندگان در پژوهش و آماده‌سازی این مقاله مشارکت داشته‌اند.

تعارض منافع
بنابر اظهار نویسندگان، این مقاله تعارض منافع ندارد.

تشکر و قدردانی
از همکاران عزیز در دانشگاه علوم‌پزشکی جهرم و معاونت پژوهشی برای حمایت مادی و معنوی از این طرح، تقدیر و تشکر به عمل می‌آید.

 

1. Trabelsi H, Dendana F, Sellami A, Sellami H, Cheikhrouhou F, Neji S, et al. Pathogenic free-living amoebae: Epidemiology and clinical review. Pathol Biol. 2012; 60(6):399-405.  [DOI:10.1016/j.patbio.2012.03.002] [PMID]
2. Visvesvara GS, Moura H, Schuster FL. Pathogenic and opportunistic free-living amoebae: Acanthamoeba spp., Balamuthia mandrillaris, Naegleria fowleri, and Sappinia diploidea. FEMS Immunol Med Microbiol. 2007; 50(1):1-26.  [DOI:10.1111/j.1574-695X.2007.00232.x] [PMID]
3. John DT, Petri Jr W. Markell and Voge's medical parasitology. Amsterdam: Elsevier Health Sciences; 2006. [Link]
4. Schmidt TJ, Khalid SA, Romanha AJ, Alves TM, Biavatti MW, Brun R, et al. The potential of secondary metabolites from plants as drugs or leads against protozoan neglected diseases-part II. Curr Med Chem. 2012; 19(14):2176-228.  [DOI:10.2174/092986712800229023]
5. Chu DM, Miles H, Toney D, Ngyuen C, Marciano-Cabral F. Amebicidal activity of plant extracts from Southeast Asia on Acanthamoeba spp. Parasitol Res. 1998; 84(9):746-52. [DOI:10.1007/s004360050480] [PMID]
6. Hajihossein R, Eslamirad Z, Rafiei F, Naderi G, Assadi M. Anti-Acanthamoeba effect of Camellia sinensis extract (black and green tea) in vitro. J Med Plants. 2020; 19(73):163-9. [DOI:10.29252/jmp.1.73.163]
7. Shafizadeh Gerdkohi H, Ramezani V, Eslahi E, Emami A, Ranjbar AM, Tavakoli F. [Effect of hydroalcoholic extract of oliveria decumbens vent on diarrhea and symptoms of morphine withdrawal syndrome in mice (Persian)]. Sci J Kurdistan Univ Med Sci. 2021; 26(3):1-12.  [DOI:10.52547/sjku.26.3.1]
8. Mahboubi M, Feyzabadi Mm, Haghi G, Hosseini H. Antimicrobial activity and chemical composition of essential oil from oliveria decumbens vent. Iran J Med Aromat Plants. 2008; 24(1):56-65. [Link]
9. Jadidi A, Golitaleb M, Sadrkia G. [The comparision of the antimicrobial effect of P. harmala smoke and hydrogen peroxide on hospital germs (Persian)]. Complement Med J. 2017; 7(2):1897-905. [Link]
10. Moloudizargari M, Mikaili P, Aghajanshakeri S, Asghari MH, Shayegh J. Pharmacological and therapeutic effects of Peganum harmala and its main alkaloids. Pharmacogn Rev. 2013; 7(14):199-212. [DOI:10.4103/0973-7847.120524] [PMID] [PMCID]
11. Lansky EP, Lansky ES, Lansky S, Paavilainen HM. Harmal: The genus peganum. Florida:  CRC Press; 2017. [DOI:10.1201/9781315118758]
12. Nayeri Chegeni T, Ghafarifar F, Khoshzaban F, Dalimi Asl A. [The effects of artemisinin and aqueous and alcoholic extracts of Artemisia annua on Acanthamoeb genotype T4 in vitro (Persian)]. Pathobiol Res. 2016; 19(2):75-87. [Link]
13. Badria F, Hetta M, Sarhan RM, El-Din ME. Lethal effects of Helianthemum lippii (L.) on Acanthamoeba castellanii cysts in vitro. Korean J Parasitol. 2014; 52(3):243-9. [DOI:10.3347/kjp.2014.52.3.243] [PMID] [PMCID]
14. Marciano-Cabral F, Cabral G. Acanthamoeba spp. as agents of disease in humans. Clin Microbiol Rev. 2003; 16(2):273-307. [DOI:10.1128/CMR.16.2.273-307.2003] [PMID] [PMCID]
15. Niyyati M, Dodangeh S, Lorenzo-Morales J. A review of the current research trends in the application of medicinal plants as a source for novel therapeutic agents against Acanthamoeba infections. Iran J Pharm Res. 2016; 15(4):893-900. [PMID]
16. Wink M. Medicinal plants: A source of anti-parasitic secondary metabolites. Molecules. 2012; 17(11):12771-91. [DOI:10.3390/molecules171112771] [PMID] [PMCID]
17. Chegeni TN, Fakhar M, Ghaffarifar F, Saberi R. Medicinal plants with anti-Acanthamoeba activity: A systematic review. Infect Disord Drug Targets. 2020; 20(5):620-50. [DOI:10.2174/1871526519666190716095849] [PMID]
18. Arjmand Shabestary A, Khaloei M, Arjomandzadegan M, Eslamirad Z, Ghasemikhah R. [Effects of Zataria, Mentha Pulegium, Oregano spp essential oil and hydroalcholic extract of hypericum perforatum on Cyst of Acanthamoeba spp In Vitro (Persian)].  J Arak Uni Med Sci. 2017; 20(8):1-8. [Link]
19. Nayeri Chegen T, Ghaffarifar F, Khoshzaban F, Dalimi Asl A. [Effect of aqueous extract of peganum harmala on acanthamoeba in vitro (Persian)]. Qom Univ Med Sci J. 2018; 12(6):20-8. [DOI:10.29252/qums.12.6.20]