مقدمه
نارسایی حاد کلیه یک کاهش ناگهانی در عملکرد کلیه ناشی از سمیت کلیه‌ها است. آسیب حاد کلیه با علائم افزایش کراتینین پلاسما، تغییر در برون‌ده ادراری، ازوتمی و اختلال در تعادل اسید و باز همراه است [2 ،1].
در این نوع سمیت کلیوی اسمولالیته ادرار افزایش و حجم آن کاهش پیدا می‌کند. داروها و توکسین‌های مختلف از طریق ایجاد التهاب تولید گونه‌های فعال اکسیژن  و اختلال سلولی می‌توانند اثرات مخرب مستقیمی روی سلول‌های بافت عروقی، لوله‌ای، گلومرولی و بافت بینابینی کلیه‌ها داشته باشند [3].
یکی از انواع داروهایی که به طریق برون‌زاد می‌تواند نارسایی حاد کلیوی ایجاد کند، دفراسیروکس (اکسجید) است. دفراسیروکس یک شلات‌کننده انتخابی آهن است و تمایل زیادی برای اتصال به آهن سه ظرفیتی دارد.
از این دارو برای درمان وضعیت‌های بیش بار مزمن آهن ناشی از تزریق مکرر خون در بیماران مبتلا به انواع کم خونی، از جمله بیماران بالای شش سال مبتلا به بتا تالاسمی ماژور (بیمارانی که در ماه بیشتر از 7 میلی‌لیتر به ازای هر کیلوگرم خون دریافت می‌کنند) استفاده می‌شود. عوارض گوناگونی، از جمله عوارض پوستی، مغزی، مخاطی، گوارشی و ادراری تناسلی برای دفراسیروکس شناخته شده است [4].
مصرف دفراسیروکس به دلیل ایجاد استرس اکسیداتیو و اختلال عملکرد در توبول‌های کلیوی از طریق افزایش سرعت و میزان آپوپتوز سلول‌ها، به‌خصوص لوله نزدیک، باعث نارسایی حاد کلیوی می‌شود. دفراسیروکس پس از ایجاد سمیت کلیوی می‌تواند منجر به نیاز به دیالیز و حتی مرگ شود [5 ،4].
ویتامین (C6H8O6) C با نام علمی آسکوربیک اسید یک آنتی‌اکسیدان قابل حل در آب است که برای بدن ضروری است و به طور ویژه در میوه‌ها و سبزیجات یافت می‌شود. ویتامین C به عنوان یک کوآنزیم ضروری در مسیرهای فشار اکسیداتیو نقش ایفا می‌کند و یک آنتی‌اکسیدان مهم و جمع‌آوری‌کننده عوامل اکسیدانی است و از آسیب غشای سلولی ناشی از رادیکال‌های اکسیداتیو در محیط‌های آبی جلوگیری می‌کند [6].
ویتامین C ترکیبات دارای نیتروژن و اکسیژن فعال را به مولکول‌های پایدارتر تبدیل می‌کند. درنتیجه ویتامین C به عنوان یک عامل درمانگر در درمان اختلالاتی که مرتبط با افزایش رادیکال‌های آزاد است، شناخته می‌شود [8 ،7]. ویتامین C ساخته شدن نیتریک اکساید را در سلول‌های اندوتلیال عروق افزایش می‌دهد. اثرات مخرب گونه‌های فعال اکسیژن که منجر به ایجاد استرس اکسیداتیو می‌شود، می‌تواند با آنزیم سوپراکسید دیسموتاز و برخی آنتی‌اکسیدان‌ها مثل ویتامین C کاهش یابد [9 ،6].
مطالعات قبلی نشان داده است که استرس اکسیداتیو جزء مهم‌ترین علل ایجاد یا پیشرفت سمیت کلیوی دفراسیروکس است؛ بنابراین به نظر می‌رسد که استفاده از آنتی‌اکسیدان‌ها مانند ویتامین C می‌تواند برای درمان یا پیشگیری از آسیب‌های کلیوی حاصل از دفراسیروکس مؤثر باشد. در این مطالعه اثر مصرف هم‌زمان ویتامین C بر سمیت کلیوی دفراسیروکس بررسی شد.
مواد و روش‌ها  
این مطالعه تجربی روی 32 سر موش صحرایی سفید نر بالغ از  نژاد ویستار با وزن بین 250-200 گرم صورت گرفت. موش‌ها در شرایط کنترل‌شده 12 ساعت تاریکی و 12 ساعت روشنایی و در درجه حرارت محیط حدود 2±23 درجه سانتی‌گراد با دسترسی آزاد به مقادیر دلخواه آب و غذا نگهداری شدند. تمام کدهای اخلاقی تأیید شده توسط وزارت بهداشت، درمان و آموزش پزشکی و دانشگاه علوم‌پزشکی اراک در مورد نگهداری و نحوه انجام آزمایشات رعایت شد.
گروه‌های مورد مطالعه
گروه کنترل: موش‌های این گروه هیچ‌گونه دارو دریافت نکردند و فقط نرمال سالین، به مدت هشت روز به صورت داخل صفاقی تزریق شد (n=‌10).
گروه با سمیت کلیوی دفراسیروکس: به موش‌های این گروه دفراسیروکس (به میزان روزانه 75 میلی‌گرم به ازای هر کیلوگرم) و نرمال سالین به طور هم‌زمان، به مدت هشت روز به صورت داخل صفاقی تزریق شد (10‌n=) [10].
3- گروه دفراسیروکس و درمان هم‌زمان با ویتامین C: موش‌های این گروه داروی دفراسیروکس (به میزان 75 میلی‌گرم به ازای هر کیلوگرم روزانه) درمان هم‌زمان با ویتامین C (به میزان 200 میلی‌گرم به ازای هر کیلوگرم روزانه)، به مدت هشت روز به صورت تزریق داخل صفاقی دریافت کردند (10‌=n) [11].
در روز هشتم حیوانات به مدت شش ساعت در قفس متابولیک قرار گرفتند و پس از جمع‌آوری نمونه ادرار، بیهوش شده، سپس با استفاده از سرنگ هپارینه خون‌گیری از آئورت انجام شد. 
برای استحصال پلاسما، خون گرفته‌شده به مدت 15 دقیقه با سرعت rpm 3000 سانتریفیوژ شد. به منظور مشخص کردن شدت آسیب کلیوی مقادیر کراتینین و نیتروژن اوره خون (BUN)، غلظت سدیم (+Na) و پتاسیم (+K) همچنین اسمولالیته در نمونه‌های پلاسما و ادرار اندازه‌گیری شد. با استفاده از مقادیر اندازه‌گیری‌شده در آزمایشگاه میزان کلیرانس کراتینین (CCr) و همچنین مقادیر دفع مطلق سدیم (UNaVº) و پتاسیم (UKVº)، دفع نسبی سدیم (FENa ) و پتاسیم (FEK) با استفاده از فرمول‌های 1، 2، 3، 4، 5 و 6 محاسبه شد [12]. 

1.
V°(μl/min.gkw) = (1000× UFR)/(KW×720)
2.
CCr(ml/min.gkw) = (V°/1000×UCr)/PCr
3.
UNaV˚ (μmol/min.gkw) = (V°×UNa)/ 1000
4.
UKV˚(µmol/min.gkw) = (V˚× UK)/ 1000
5. 
FENa = (UNa×PCr)/(PNa×UCr) × 100
6. 
FEK = (Uk×PCr)/(Pk×UCr) ×100
بعد از خارج کردن هر دو کلیه و توزین آن‌ها، کلیه چپ جهت مطالعه بافتی در فرمالین 10 درصد و جهت مطالعه بیوشیمیایی و اندازه‌گیری میزان توان آنتی‌اکسیدانی احیای آهن و میزان مالون دی‌آلدهید و کلیه راست در نیتروژن مایع به سرعت فریز و سپس در منهای 20 درجه سانتی‌گراد نگهداری شدند.
روش اندازه‌گیری میزان FRAP بافت کلیه
ظرفیت آنتی‌اکسیدانی نمونه‌ها با استفاده از روش بنزی اندازه‌‌‌گیری شد. بافت کلیه در محلول بافر فسفاتی هموژنیزه شد. سپس 50 میکرولیتر از بافت هموژنیزه‌شده کلیه به 1/5 میلی لیتر از معرف FRAP اضافه شد. 
Fe3+ در حضور مواد آنتی‌اکسیدان احیاشده و با TPTZ  کمپلکس آبی رنگ Fe2+-TPTZ تولید شد. غلظت ماده آنتی‌اکسیدان با میزان رنگ آبی تولید‌شده متناسب است. با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر (SpectroLab 7500 UV)ساخت انگلیس مقدار جذب نوری در طول موج 593 نانومتر در برابر شاهد آن اندازه‌گیری شد [13].
روش اندازه‌گیری میزان MDA در نمونه‌های بافت کلیوی 
 مقدار 1500 میکرولیتر از محلول اسید استیک 20 درصد، 1500 میکرولیتر از محلول تیو باربیتوریک (TBA) 0/8 درصد و 200 میکرولیتر از محلول SDS 8/1 درصد به 200 میکرولیتر از بافت هموژنیزه‌شده کلیه اضافه شد. سپس با اضافه کردن آب مقطر، حجم آن به 4 میلی‌لیتر رسانده شد. لوله‌های آزمایش محتوی سوسپانسیون به مدت 60 دقیقه در95 درجه سانتی‌گراد در حمام آبی ساخت آمریکا حرارت داده شدند.
 سپس لوله‌ها از حمام آبی خارج و به مدت 10 دقیقه در آب یخ قرار گرفتند. پس از سرد شدن لوله‌ها، به هریک از آن‌ها 4 میلی‌لیتر ان ـ ‌بوتانل اضافه و لوله‌ها به مدت 10 دقیقه در دور  rpm 4000 سانتریفیوژ شده و فاز رویی صورتی رنگ به آرامی با سمپلر برداشته شد و جذب نوری در طول موج 325 نانومتر با اسپکتروفتومتر (SpectroLab 7500 UV) ساخت انگلیس اندازه‌‌گیری شد [14].
بررسی هیستوپاتولوژیک کلیه‌ها
ابتدا نمونه بافتی در یک محلول فرمالین 10 درصد فیکس شد. پس از طی کردن مراحل آب‌گیری و آغشتگی با پارافین، قالب‌گیری پارافینی از بافت کلیه تهیه شد. آب‌گیری با قرار دادن پی‌در‌پی در محلول‌های اتانول 50، 70، ‌96 و 100 درصد انجام شد. سپس پاک‌سازی با قرار دادن در محلول زایلن انجام ‌شد. 
قطعات در قالب قرار گرفته و قالب با پارافین ذوب‌شده پر شد. از این قالب‌ها برش‌های 5 میکرومتری توسط میکروتوم تهیه و روی لام شیشه‌ای قرار گرفته و نمونه‌ها با کمک دو رنگ بازی هماتوکسیلین و اسیدی ائوزین رنگ‌آمیزی شد. در بررسی هیستوپاتولوژیک روی برش‌ها نواحی کورتکس، مدولای داخلی و مدولای خارجی به طور جداگانه مطالعه شد [15]. 
در بخش گلومرولی تغییرات فضای کپسول بومن، تعداد گلبول‌های قرمز گلومرولی و درصد آسیب گلومرولی بررسی شد. در بخش توبولی نیز ریزش سلول‌های اپی‌تلیالی به داخل لومن، ایجاد قالب‌های پروتئینی در داخل توبول، واکوئل‌دار شدن سلول‌های توبولی، نکروزه شدن سلول‌های توبولی و درصد کل آسیب توبولی بررسی شد.
میزان درصد آسیب ایجاد‌شده توسط متخصص پاتولوژی  مشخص و به صورت زیر درجه‌بندی شد. فقدان آسیب معادل آسیب درجه صفر، آسیب بین 1 تا 25 درصد معادل آسیب درجه 1، آسیب بین 25 تا 50 درصد معادل آسیب درجه 2، آسیب بین 50 تا 75 درصد معادل آسیب درجه 3 و آسیب بین 75 تا 100 درصد معادل آسیب درجه 4 درجه‌بندی شد [16].
یافته‌ها
اثر ویتامین C بر کلیرانس کراتینین (CCr)، دفع مطلق و نسبی سدیم (UNaV˚,FENa%) و دفع مطلق و نسبی پتاسیم (UKV˚, FEK%)

نتایج نشان داد در مقایسه با گروه کنترل (0/08±1/7) میلی‌لیتر در دقیقه به ازای هر کیلوگرم)، کلیرانس کراتینین به طور معناداری در گروه اکسجید (0/1±0/59، 0/001 نتایج نشان داد دفع نسبی سدیم به طور معناداری در گروه اکسجید (0/8±27/6) نسبت به گروه کنترل (0/07±0/611، 0/001 نتایج نشان داد در گروه دفراسیروکس دفع نسبی پتاسیم (58/11±1258/58) به طور معناداری در مقایسه با گروه کنترل (1/3±18/15، 0/001 نتایج نشان داد دفع مطلق سدیم در گروه دفراسیروکس (0/001 نتایج نشان داد دفع مطلق پتاسیم در گروه دفراسیروکس (0/098±13/41 0/001)

اثرات ویتامین C بر سطوح ادراری کراتینین ([Cr]u)، اوره ([BUN]u)، سدیم ([Na]u)، پتاسیم ([K]u)، منیزیم ([Mg]u)، اسمولالیته ([osmol]u)
نتایج نشان داد غلظت ادراری کراتینین در گروه دفراسیروکس (1/55±32/7 میلی‌گرم در دسی‌لیتر) از گروه کنترل (0/3±68/33 میلی‌گرم در دسی‌لیتر) و گروه درمان هم‌زمان با ویتامین C (6/7±69/8 میلی‌گرم در دسی‌لیتر) به صورت معناداری بیشتر بود (0/001>P). گروه درمان هم‌زمان با ویتامین C (6/7±69/8 میلی‌گرم در دسی‌لیتر) با گروه کنترل تفاوت معناداری نداشت.
در مورد غلظت ادراری اوره نتایج نشان داد درگروه کنترل (0/6±140 میلی‌گرم در دسی‌لیتر) و گروه درمان هم‌زمان با ویتامینC  در مقایسه با گروه دفراسیروکس (0/14±72 میلی‌گرم در دسی‌لیتر) افزایش معناداری داشتند (0/001>P). مقادیر گروه‌های درمان با ویتامین C (3/82±137 میلی‌گرم در دسی‌لیتر) در مقایسه با گروه کنترل (0/6±140 میلی‌گرم در دسی‌لیتر)  تفاوت معناداری نداشت (جدول شماره 1). 


نتایج حاصله در مورد غلظت ادراری سدیم نشان داد که گروه دفراسیروکس (4/55±220/4 میکر‌مول در میلی‌لیتر) مقادیر بیشتری در مقایسه با گروه کنترل (0/8±125/44 میکر‌مول در میلی‌لیتر) و گروه درمان هم‌زمان با ویتامین C (3/1±127/4 میکر‌مول در میلی‌لیتر) دارد (0/001>P). غلظت ادراری سدیم گروه‌های درمان هم‌زمان با ویتامین C با گروه کنترل تفاوت معناداری نداشت. 
نتایج نشان داد غلظت ادراری پتاسیم در گروه کنترل (0/45±134/27 میکر‌مول در میلی‌لیتر) در مقایسه با سایر گروه‌ها با یکدیگر تفاوت معنادار نداشت (جدول شماره 1) و غلظت ادراری منیزیم در گروه دفراسیروکس (113/5±516/7 میکر‌مول در میلی‌لیتر) در مقایسه با گروه کنترل (42/1±348 میکر‌مول در میلی‌لیتر) و گروه درمان هم‌زمان با ویتامین C (80/5±374/5 میکر‌مول در میلی‌لیتر) تفاوت معناداری داشت (0/001>P). غلظت ادراری منیزیم در گروه درمان هم‌زمان با ویتامین C در مقایسه با گروه کنترل اختلاف معناداری نداشت (جدول شماره 1).
نتایج نشان داد که اسمولالیته ادرار در گروه دفراسیروکس (18±612/5 میلی‌اسمول در یک کیلو‌گرم آب) در مقایسه با گروه کنترل (71/66±1735 میلی‌اسمول در یک کیلو‌گرم آب) و گروه درمان هم‌زمان با ویتامینC  (60/9±1681) کاهش معناداری داشت (0/001>P). اسمولالیته ادرار در گروه درمان هم‌زمان با ویتامین C در مقایسه با گروه کنترل اختلاف معناداری نداشت (جدول شماره 2).


اثر ویتامین C بر سطوح پلاسمایی کراتینین [Cr]p))، اوره ([BUN]p)، سدیم ([Na]p)، پتاسیم ([K]p)، منیزیم ([Mg]p)، اسمولالیته ([osmol]p) 
نتایج نشان داد که غلظت پلاسمایی کراتینین در گروه دفراسیروکس (0/06±8/2 میلی‌گرم در دسی‌لیتر) از گروه کنترل (0/03±0/46 میلی‌گرم در دسی‌لیتر) و درمان هم‌زمان با ویتامین C (0/11±0/52 میلی‌گرم در دسی‌لیتر) به صورت معناداری بیشتر بود (0/001>P). غلظت پلاسمایی کراتینین در گروه درمان هم‌زمان با ویتامین C (0/11±0/52 میلی‌گرم در دسی‌لیتر) در مقایسه با گروه کنترل تفاوت معناداری نداشت (جدول شماره 1).
نتایج نشان داد که غلظت پلاسمایی اوره در گروه دفراسیروکس (2/5±93/3 میلی‌گرم در دسی‌لیتر) در مقایسه با گروه کنترل (0/076±26/6 میلی‌گرم در دسی‌لیتر) و گروه درمان هم‌زمان با ویتامین C (1/9±32/5 میلی‌گرم در دسی‌لیتر) تفاوت معناداری داشت (0/001>P). مقادیر غلظت پلاسمایی اوره در گروه درمان هم‌زمان با ویتامین C در مقایسه با گروه کنترل تفاوت معناداری نداشت (جدول شماره 1).
نتایج نشان داد که غلظت پلاسمایی سدیم در گروه دفراسیروکس (0/16±200/2 میکرو‌مول در میلی‌لیتر) در مقایسه با گروه کنترل (5/6±138/33 میکرو‌مول در میلی‌لیتر) و در گروه درمان هم‌زمان با ویتامین C (1/5±141/13 میکرو‌مول در میلی‌لیتر) به صورت معناداری افزایش داشت (0/001>P). مقایسه غلظت پلاسمایی سدیم بین گروه‌های درمان هم‌زمان با ویتامین C (1/5±141/13 میکرو‌مول در میلی‌لیتر) با گروه کنترل (5/6±138/33 میکرو‌مول در میلی‌لیتر) تفاوت معناداری نداشت (جدول شماره 1).
نتایج نشان داد که دفراسیروکس، غلظت پلاسمایی پتاسیم (0/66±5/95 میکرو‌مول در میلی‌لیتر) را در مقایسه با گروه کنترل (0/18±4/98 میکرو‌مول در میلی‌لیتر) به صورت معناداری افزایش داد. درمان هم‌زمان با ویتامین C (0/7±5/3 میکرو‌مول در میلی‌لیتر) سبب کاهش معنادار در غلظت پلاسمایی پتاسیم در مقایسه با گروه دفراسیروکس شد (0/05 بررسی نتایج نشان داد که در غلظت منیزیم پلاسما گروه دفراسیروکس (0/41±5/56 میکرو‌مول در لیتر) در مقایسه با گروه کنترل (0/21±2/34 میکرو‌مول در لیتر) افزایش معناداری مشاهده شد. درمان هم‌زمان با ویتامین C (0/11±2/47 میکرو‌مول در لیتر) در مقایسه با گروه دفراسیروکس به صورت معناداری غلظت منیزیم پلاسما را کاهش داد، ولی تفاوت معناداری با گروه کنترل نداشت.
نتایج نشان داد که اسمولالیته پلاسما در گروه دفراسیروکس (1/4±324/3 میلی‌اسمول در یک کیلوگرم آّب) در مقایسه با گروه کنترل (2/6±291/2 میلی‌اسمول در یک کیلوگرم آّب) و گروه درمان هم‌زمان با ویتامین C (1/8±294/1 میلی‌اسمول در یک کیلوگرم آّب) تفاوت معناداری داشت. اسمولالیته پلاسما در گروه کنترل در مقایسه با گروه درمان هم‌زمان با ویتامین C از لحاظ آماری تفاوت معناداری  نداشت (جدول شماره 2).
اثرات ویتامین C بر سطوح MDA و FRAP در بافت کلیه
نتایج این مطالعه نشان داد که میزان MDA بافتی به طور معناداری در گروه دفراسیروکس (0/5±4/31 میکرو‌مول در هر گرم وزن کلیه) در مقایسه با گروه کنترل (0/14±1/89 میکرو‌مول در هر گرم وزن کلیه) بیشتر بود (0/001>P). میزان MDA بافتی در گروه درمان هم‌زمان با ویتامین C (0/355±1/94 میکرو‌مول در هر گرم وزن کلیه) در مقایسه با گروه دفراسیروکس کاهش معناداری داشت (0/001>P)، ولی در مقایسه با گروه کنترل تفاوت معناداری نداشت (جدول شماره 2 و تصویر شماره 2).

نتایج این مطالعه نشان داد که میزان FRAP بافت کلیه در گروه دفراسیروکس (0/61±0/75 میکرو‌مول در هر گرم وزن کلیه) در مقایسه با گروه کنترل (0/12±1/13 میکرو‌مول در هر گرم وزن کلیه) کاهش معناداری داشت (0/001>P)، ولی درمان هم‌زمان با ویتامین C (0/25±1/07 میکرو‌مول در هر گرم وزن کلیه) میزان FRAP را به صورت معناداری افزایش داد (0/001>P). میزان FRAP بافت کلیه در گروه درمان هم‌زمان با ویتامین C تفاوت معناداری با گروه کنترل نداشت (جدول شماره 2 و تصویر شماره 3). 

اثرات ویتامین C بر تغییرات هیستوپاتولوژیک
اثرات دفراسیروکس و نیز اثرات ویتامین C بر تغییرات هیستوپاتولوژیک بافت کلیوی در تصویر شماره 4 نشان داده شده است.

در گروه دفراسیروکس، نکروز سلول‌های توبولی، تشکیل قالب‌های پروتئینی در لومن توبول، واکوئولیزاسیون سلول‌های توبولار، افزایش فضای کپسول بومن و کاهش تعداد گلبول‌های قرمز در گلومرول دیده شد که در مقایسه با گروه کنترل و نیز گروه‌های درمان‌شده با ویتامین C آن‌ها معنادار بود (0/001>P).
بررسی هیستوپاتولوژیک نمونه‌های کلیوی حاصل از گروه درمان هم‌زمان با ویتامین C تفاوت معناداری نسبت به گروه کنترل نداشت (تصویر شماره 1 و جدول شماره 3). 

بحث 
نتایج این مطالعه نشان داد که ویتامین C با کاهش اوره، کراتینین پلاسما، دفع نسبی و مطلق سدیم، پتاسیم، MDA و افزایش کلیرانس کراتینین و FRAP سبب کاهش سمیت کلیوی ناشی از دفراسیروکس شد. مصرف هم‌زمان ویتامین C همراه با دفراسیروکس با کاهش استرس اکسیداتیو سبب حفاظت کلیه‌ها شد.
مطالعات قبلی نشان داد که ویتامین C میزان استرس اکسیداتیو را هنگام ایجاد سمیت کلیوی جنتامایسین کاهش می‌دهد [1] اثرات نفروتوکسیک داروی دفراسیروکس نیز به عنوان یک شلاتور آهن در مطالعات قبلی اثبات شده است [17، 18]. در شرایط بالینی اینکه چه زمانی درمان را شروع کنیم و آیا بعد از ایجاد سمیت کلیوی یا قبل از ایجاد آن یا درمان هم‌زمان می‌تواند نتایج بسیار متفاوت داشته باشد؟ در این مطالعه اثر ویتامین C به صورت هم‌زمان با ایجاد سمیت کلیوی با دفراسیروکس بررسی شد.
نتایج این تحقیق نشان داد که درمان هم‌زمان با ویتامین C می‌تواند از سمیت کلیوی ایجاد‌شده با داروی دفراسیروکس جلوگیری کند [1]. در این مطالعه تجویز اکسجید با دُز 75 میلی‌گرم در کیلوگرم به مدت هشت روز به کاهش مشهود عملکرد کلیوی منجر شد و توانست در توبول‌های کلیه رَت‌ها با ایجاد تغییرات ساختاری و همچنین ایجاد نکروز سمیت کلیوی ایجاد کند که این نتایج مشابه مطالعات قبلی بود [5 ،4].
در این مطالعه سمیت کلیوی دفراسیروکس با سنجش پارامترهایی همچون کراتینین، اوره، سدیم، پتاسیم و دفع نسبی و مطلق آن‌ها در ادرار و سرم ارزیابی شد. سطح کراتینین سرم به طور مشهودی در سمیت کلیوی ایجاد‌شده با دفراسیروکس افزایش یافته بود. سطح کراتینین سرمی در گروه رَت‌هایی که دفراسیروکس را به‌تنهایی دریافت کرده بودند، تقریباً شانزده برابر بیشتر از سایر گروه‌ها بود. این مسئله تأیید‌کننده آسیب ایجادشده با دفراسیروکس و سمیت کلیوی آن است. 
یکی از عوامل مؤثر در ایجاد آسیب کلیوی ایجاد‌شده با دفراسیروکس، استرس اکسیداتیو است که سبب افزایش MDA و کاهش FRAP شد. MDA یک شاخص میزان پراکسیداسیون لیپیدی است و FRAP میزان توان آنتی‌اکسیدانی بافت کلیه را نشان می‌دهد. کاهش FRAP و افزایش MDA بیانگر افزایش آسیب سلولی به واسطه رادیکال‌های آزاد و پراکسیدها است [19]. 
در این مطالعه تمام رَت‌های درمان‌شده با ویتامین C نسبت به گروه دفراسیروکس سطوح پایین‌تری از MDA را داشتند. همچنین میزان FRAP در بافت کلیه رَت‌های درمان‌شده با ویتامین C بسیار بیشتر از گروه دفراسیروکس بود. این نتایج، مشابه تحقیقات قبلی بود که اثرات ویتامین C در سمیت کلیوی ناشی از داروهای مختلف را بررسی کرده بودند [8]. 
استونداگ و همکارانش نشان دادند که تجویز گلیسرول، میزان کراتینین پلاسما و MDA بافتی به میزان چشمگیری افزایش داد. این فاکتورها در گروهی که با ویتامین C تحت درمان قرار گرفته بودند، نسبت به گروه گلیسرول کاهش معناداری داشتند. در این مطالعه، تأثیر مثبت ویتامین C در آسیب حاد کلیوی میوگلوبینوریک ایجاد‌شده با گلیسرول در رَت اثبات شد [20].
آسیب سلول‌های اپی‌تلیالی سبب کاهش توانایی بازجذب یون‌های مختلف، از جمله یون سدیم، پتاسیم و منیزیم می‌شود. در این مطالعه، موش‌هایی که دفراسیروکس دریافت کردند، سطوح سدیم، پتاسیم و منیزیم ادراری بیشتری نسبت به سایر گروه‌ها داشتند که نشان‌دهنده ایجاد آسیب کلیوی در این گروه بود. با اندازه‌گیری سطوح ادراری و سرمی یون‌ها می‌توان میزان و شدت آسیب کلیوی را با استفاده از اندازه‌گیری مقدار دفع نسبی و مطلق این یون‌ها مشخص کرد.
دفع نسبی سدیم و پتاسیم حاصل میزان بازجذب و ترشح است که مقدار دفع این دو یون را نشان می‌دهد. محاسبه دفع نسبی سنجش مستقیم، توانایی بازجذب یون‌های فیلترشده است [21]. در گروه درمان هم‌زمان با ویتامین C در مقایسه با گروه دفراسیروکس میزان کمتری از دفع نسبی یون‌های سدیم و پتاسیم مشاهده شد که نشان‌دهنده جلوگیری از آسیب کلیوی بود.
موریرا و همکارانش نشان دادند که ویتامین C با کاهش گونه‌های فعال اکسیژن، سمیت کلیوی ناشی از تجویز جنتامایسین را کاهش می‌دهد. نتایج آسکوربیک اسید (ویتامین C) بر سمیت کلیوی دفراسیروکس با کاهش میزان کراتینین و اوره خون، میزان MDA بافتی با کاهش استرس اکسیداتیو مشابه اثر ویتامین C روی سمیت کلیوی جنتامایسین است [8]. 
نتایج این مطالعه نشان داد که داروی دفراسیروکس می‌تواند سبب افزایش غلظت پلاسمایی کراتینین، اوره، دفع ادراری سدیم، پتاسیم و منیزیم و کاهش کلیرانس کراتینین، اوره و نیز کاهش دفع ادراری آن‌ها ‌شود که این نتایج مطابق با مطالعات قبلی بود [22 ،18].
افزایش رادیکال‌های آزاد سبب ایجاد اختلال و آسیب کلیوی است که می‌تواند سبب آسیب‌های توبولی و گلومرولی شود. علت ایجاد تغییرات در عملکرد کلیه‌ها می‌تواند به علت کاهش ضریب فیلتراسیون گلومرولی (Kf) و یا نکروز سلول‌های توبولی و در پی آن کاهش تعداد نفرون‌های فعال و GFR باشد [23 ،22]. 
دفراسیروکس می‌تواند به علت چربی‌دوست‌ بودن به راحتی وارد سلول‌ها شود، اما به راحتی دفع نمی‌شود؛ چراکه در سلول ترکیبات با ظرفیت یونی بالایی را با آهن ایجاد می‌کند [24]. سمیت کلیوی دفراسیروکس با تخریب سلول‌های اپی‌تلیالی، افزایش نکروز و فیبروز بافت کلیه و همچنین آتروفی توبولی و گلومرولی بر عملکرد کلیه است [25 ،3]. در مکانیسم‌های سمیت کلیوی دفراسیروکس احتمالاً استرس اکسیداتیو فاکتور اصلی آسیب سلولی است.
اعتقاد بر این است که سمیت کلیوی دفراسیروکس به علت تولید رادیکال‌های آزاد اکسیژن، افزایش تولید سیتوکین‌ها و القای آپوپتوز و نکروز است [26]. آپوپتوز نقش بسیار مهمی در مرگ سلولی ایفا می‌کند و احتمالاً در حذف سلول‌های آسیب دیده شرکت دارد [18].
بسیاری از داروهایی که به طور عمومی و شایع تجویز می‌شوند، از جمله آمفوتریسین ب، سیکلوسپورین، مهارکننده‌های آنزیم مبدل آنژیوتانسین و یا ونکومایسین به عنوان عوامل ایجاد‌کننده آسیب کلیوی شناخته شده‌اند. تمامی این داروها از طریق مکانیسم‌های مشابهی سبب ایجاد انواع اکسیژن فعال و ایجاد نکروز حاد توبولی از طریق کاهش خون‌رسانی یا ایجاد ایسکمی در کلیه‌ها می‌شوند [27]. ویتامین C با توجه به قابلیت آنتی‌اکسیدانی خود خاصیت محافظتی در مقابل انواع گونه‌های اکسیژن فعال را داراست و به همین دلیل اثر محافظتی خود را اعمال می‌کند [26].
تجویز ویتامین C باعث حفظ معنادار کلیرانس کراتینین و افزایش معنادار غلظت پلاسمایی کراتینین نسبت به گروه دفراسیروکس شد. این نتایج مطابق با نتایج مطالعات قبلی بوده است [28 ،20 ،‌8]. نتایج مطالعات گذشته اثرات محافظتی ویتامین C روی آسیب حاد کلیوی ناشی از جنتامایسین نشان دادند که نتایج مشابه یافته‌های حاصل از مطالعه حاضر بود [30 ،29]. در مقالات متعددی علت اختلالات عملکردی توبول پروگزیمال را اختلال در فعالیت Na-K-ATPase ،Mg-ATPase، سوکسینیک دهیدروژناز و 5-نوکلئوتیداز بیان کرده‌اند [17].
دفراسیروکس باعث افزایش دفع ادراری سدیم و پتاسیم و FENa% و FEK% شد. دفع نسبی سدیم و پتاسیم در گروه درمان هم‌زمان با ویتامین C کمتر از گروه دفراسیروکس و نزدیک به نتایج حاصله از گروه کنترل بود. مطالعات گذشته نشان دادند که اثر کاهشی ویتامین‌ C در دفع سدیم و پتاسیم می‌تواند به علت حفظ عملکرد جذبی توبولی سدیم و پتاسیم باشد.
نتایج نشان دادند که اسمولالیته پلاسما بین گروه درمان با ویتامین C نسبت به گروه دفراسیروکس تفاوت معنادار دارد. اسمولالیته ادراری نیز مشابه اسمولالیته پلاسما بود. مطالعات پیشین نشان داده است که کاهش اسمولالیته ادرار با داروهای نفروتوکسیک می‌تواند به علت اثر آن روی کاهش بیان AQP2 باشد [31, 32, 33]. 
درمان با دفراسیروکس و آسیب‌های توبولی در مدل‌های حیوانی به شکل واکوئلیزاسیون سلول‌های پروگزیمال مشاهده شده است [5]. مطالعات در زمینه سمیت کلیوی در موش‌ها و میمون‌های مارموست که اضافه باری آهن نداشتند نیز نشان دادند که درمان با اکسجید می‌تواند سبب واکوئل‌دار شدن سلول‌های اپی‌تلیالی توبول پروگزیمال و افزایش بیومارکرهای خونی در پی آسیب کلیوی شود [34]. 
در مدل آزمایشی ما، ارزیابی‌های بافت‌شناسی و پاتولوژیک نشان‌‌‌دهنده تغییراتی روی توبول‌های دیستال و پروگزیمال بود که تأثیر نفروتوکسیک اکسجید را روشن می‌سازد. نتایج آزمایشگاهی نیز نشانگر ارتباط قوی بین تغییرات بافتی و مورفولوژیک در AKI ناشی از اکسجید بود.
مطالعات بافت‌شناسی نشان دادند که اکسجید باعث افزایش نکروز، واکوئل‌دار شدن، افزایش فضای بومن و افزایش تشکیل قالب‌های پروتئینی نسبت به گروه کنترل می‌شود. این یافته‌ها مشابه گزارشات مطالعه گارسیا دیاز بود [18].
هدف ما بررسی درمان هم‌زمان سمیت کلیوی بود؛ چراکه در صورت اثربخش بودن آن می‌توان از همان ابتدای تجویز داروی ایجاد‌کننده سمیت کلیوی از آسیب به کلیه‌ها پیشگیری کنیم. مطالعه ما هم‌زمانی شروع درمان با دریافت اکسجید، اثربخشی چشمگیر ویتامین C را در حفظ عملکرد کلیوی نشان داد، به طوری که سطوح کراتینین، اوره، یون‌ها، اسیدیته و سایر متابولیت‌ها در سرم و ادرار گروه‌های درمان‌شده بسیار مشابه گروه کنترل بود.
نتیجه‌گیری
استفاده از ویتامین C به صورت درمان هم‌زمان با جلوگیری از تغییرات همودینامیکی، اختلال در دفع املاح و تغییرات بافتی ناشی از دفراسیروکس اثر محافظتی روی کلیه‌ها دارد. منشأ این قابلیت محافظتی می‌تواند به دلیل خاصیت آنتی‌اکسیدانی و توان به دام انداختن رادیکال‌های آزاد باشد. 

ملاحظات اخلاقی
پیروی از اصول اخلاق پژوهش
این مطالعه با کد اخلاق  IR.ARAKMU.REC.1396.309 در کمیته اخلاق در پژوهش دانشگاه علوم‌پزشکی اراک به ثبت رسیده است.

حامی مالی
نتایج این تحقیق حاصل پایان نامه آقای طه فریدونی  دانشجوی پزشکی است که در گروه فیزیولوژی (شورای پژوهشی دانشکده پزشکی و دانشگاه علوم‌پزشکی اراک) به تصویب رسیده است.

مشارکت نویسندگان
مفهو‌م‌سازی: پارسا یوسفی چایجان؛ رو‌ش‌شناسی، اعتبارسنجی و تحلیل داد‌ه‌ها: سعید حاجی‌هاشمی؛ تحقیق و بررسی: طه فریدونی و علی رهبری؛ تحلیل: سعید حاجی‌هاشمی، پارسا یوسفی چایجان و علی رهبری؛ منابع و نگارش پیش‌نویس: سعید حاجی‌هاشمی و طه فریدونی 

تعارض منافع
بنابر اظهار نویسندگان این مقاله تعارض منافع ندارد.

تشکر و قدردانی
نویسندگان از معاونت محترم آموزش و معاونت محترم تحقیقات و فناوری دانشگاه علوم‌پزشکی اراک بابت حمایت‌های مالی از این تحقیق کمال تشکر را دارند.

 

References
1.Hirschberg R, Bennett W, Scheinman J, Coppo R, Ponticelli C. Acute kidney injury due to deferoxamine in a renal transplant patient. Nephrol Dial Transplant. 2008; 23(8):2704-5. [DOI:10.1093/ndt/gfn278] [PMID]
2.Al-Khabori M, Bhandari S, Al-Huneini M, Al-Farsi K, Panjwani V, Daar S. Side effects of deferasirox iron chelation in patients with beta thalassemia major or intermedia. Oman Med J. 2013; 28(2):121-4. [DOI:10.5001/omj.2013.31] [PMID] [PMCID]
3.Dubourg L, Laurain C, Ranchin B, Pondarré C, Hadj-Aïssa A, Sigaudo-Roussel D, et al. Deferasirox-induced renal impairment in children: An increasing concern for pediatricians. Pediatr Nephrol. 2012; 27(11):2115-22. [DOI:10.1007/s00467-012-2170-4] [PMID]
4.Brosnahan G, Gokden N, Swaminathan S. Acute interstitial nephritis due to deferasirox: A case report. Nephrol Dial Transplant. 2008; 23(10):3356-8. [DOI:10.1093/ndt/gfn423] [PMID]
5.Martin-Sanchez D, Gallegos-Villalobos A, Fontecha-Barriuso M, Carrasco S, Sanchez-Niño MD, Lopez-Hernandez FJ, et al. Deferasirox-induced iron depletion promotes BclxL downregulation and death of proximal tubular cells. Sci Rep. 2017; 7:41510. [DOI:10.1038/srep41510] [PMID] [PMCID]
6.Kadkhodaee M, Khastar H, Arab HA, Ghaznavi R, Zahmatkesh M, Mahdavi-Mazdeh M. Antioxidant vitamins preserve superoxide dismutase activities in gentamicin-induced nephrotoxicity. Transplant Proc. 2007: 39(4):864-5. [DOI:10.1016/j.transproceed.2007.02.038] [PMID]
7.Zhong X, Zeng M, Bian H, Zhong C, Xiao F. An evaluation of the protective role of vitamin C in reactive oxygen species-induced hepatotoxicity due to hexavalent chromium in vitro and in vivo. J Occup Med Toxicol. 2017; 12:15. [DOI:10.1186/s12995-017-0161-x] [PMID] [PMCID]
8.Moreira MA, Nascimento MA, Bozzo TA, Cintra A, da Silva SM, Dalboni MA, et al. Ascorbic acid reduces gentamicin-induced nephrotoxicity in rats through the control of reactive oxygen species. Clin Nutr. 2014; 33(2):296-301. [DOI:10.1016/j.clnu.2013.05.005] [PMID]
9.Chen X, Touyz RM, Park JB, Schiffrin EL. Antioxidant effects of vitamins C and E are associated with altered activation of vascular NADPH oxidase and superoxide dismutase in stroke-prone SHR. Hypertension. 2001; 38(3 Pt 2):606-11. [DOI:10.1161/hy09t1.094005] [PMID]
10.Brewer C, Otto-Duessel M, Lykkesfeldt J, Nick H, Wood JC. Ascorbate status modulates reticuloendothelial iron stores and response to deferasirox iron chelation in ascorbate-deficient rats. Exp Hematol. 2012; 40(10):820-7. [DOI:10.1016/j.exphem.2012.06.005] [PMID]
11.Ghaznavi R, Kadkhodaee M, Khastar H, Zahmatkesh M. [Renal oxidative stress status and histology in gentamicin nephrotoxicity: The effects of antioxidant vitamins (Persian)]. Tehran Univ Med J. 2006; 64(5):15-22. http://tumj.tums.ac.ir/article-1-944-en.html
12.Ahmadi F, Hajihashemi S, Rahbari A, Ghanbari F. Effects of nitroglycerine on renal ischemia-reperfusion injury in adult male rats. Drug Res (Stuttg). 2019; 69(11):612-20. [DOI:10.1055/a-0958-1987] [PMID]
13.Benzie IF, Strain JJ. The ferric reducing ability of plasma (FRAP) as a measure of “antioxidant power”: The FRAP assay. Anal Biochem. 1996; 239(1):70-6. [DOI:10.1006/abio.1996.0292] [PMID]
14.Ohkawa H, Ohishi N, Yagi K. Assay for lipid peroxides in animal tissues by thiobarbituric acid reaction. Anal biochem. 1979; 95(2):351-8. [DOI:10.1016/0003-2697(79)90738-3]
15.Aydin G, Gökçimen A, Öncü M, Çicek E, Karahan N, Gökalp O. Histopathologic changes in liver and renal tissues induced by different doses of diclofenac sodium in rats. Turk J Vet  Anim Sci. 2003; 27(5):1131-40. https://www.researchgate.net/publication/281888383
16.Hajihashemi S, Jafarian T, Ahmadi M, Rahbari A, Ghanbari F. Ameliorative effects of zataria multiflora hydro-alcoholic extract on Gentamicin induced Nephrotoxicity in rats . Drug Res (Stuttg). 2018; 68(7):387-94. [DOI:10.1055/s-0043-124968] [PMID]
17.Westenfelder C, Arevalo GJ, Crawford PW, Zerwer P, Baranowski RL, Birch FM, et al. Renal tubular function in glycerol-induced acute renal failure. Kidney Int. 1980; 18(4):432-44. [DOI:10.1038/ki.1980.156] [PMID]
18.Díaz-García JD, Gallegos-Villalobos A, Gonzalez-Espinoza L, Sanchez-Niño MD, Villarrubia J, Ortiz A. Deferasirox nephrotoxicity-the knowns and unknowns. Nat Rev Nephrol. 2014; 10(10):574-86. [DOI:10.1038/nrneph.2014.121] [PMID]
19.Tataranni T, Agriesti F, Mazzoccoli C, Ruggieri V, Scrima R, Laurenzana I, et al. The iron chelator deferasirox affects redox signalling in haematopoietic stem/progenitor cells. Br J Haematol. 2015; 170(2):236-46. [DOI:10.1111/bjh.13381] [PMID]
20.Ustundag S, Yalcin O, Sen S, Cukur Z, Ciftci S, Demirkan B. Experimental myoglobinuric acute renal failure: The effect of vitamin C. Ren Fail. 2008; 30(7):727-35. [DOI:10.1080/08860220802212965] [PMID]
21.Steiner RW. Interpreting the fractional excretion of sodium. Am J Med. 1984; 77(4):699-702. [DOI:10.1016/0002-9343(84)90368-1]
22.Martínez-Salgado C, Rodríguez-Barbero A, Tavares P, Eleno N, López-Novoa JM. Role of calcium in gentamicin-induced mesangial cell activation. Cell Physiol Biochem. 2000; 10(1-2):65-72. [DOI:10.1159/000016335] [PMID]
23.Savin V, Karniski L, Cuppage F, Hodges G, Chonko A. Effect of gentamicin on isolated glomeruli and proximal tubules of the rabbit. Lab Invest. 1985; 52(1):93-102. [PMID]
24.Hider RC. Charge states of deferasirox-ferric iron complexes. Am J Kidney Dis. 2010; 55(3):614-5. [DOI:10.1053/j.ajkd.2009.10.065] [PMID]
25.Rafat C, Fakhouri F, Ribeil JA, Delarue R, Le Quintrec M. Fanconi syndrome due to deferasirox. Am J Kidney Dis. 2009; 54(5):931-4. [DOI:10.1053/j.ajkd.2009.03.013] [PMID]
26.Stojiljkovic N, Stoiljkovic M, Randjelovic P, Veljkovic S, Mihailovic D. Cytoprotective effect of vitamin C against gentamicin-induced acute kidney injury in rats. Exp Toxicol Pathol. 2012; 64(1-2):69-74. [DOI:10.1016/j.etp.2010.06.008] [PMID]
27.Patel Manali B, Deshpande S, Shah G. Evaluation of efficacy of vitamin E and N-acetyl cysteine in gentamicin-induced nephrotoxicity in rats. Ren Fail. 2011; 33(3):341-7. [DOI:10.3109/0886022X.2011.560987] [PMID]
28.Miloradovic Z, Mihailovic-Stanojevic N, Grujic-Milanovic J, Ivanov M, Kuburovic G, Markovic-Lipkovski J, et al. Comparative effects of L-arginine and vitamin C pretreatment in SHR with induced postischemic acute renal failure. Gen. Physiol. Biophys. 2009; 28:105-11. http://www.physiology.org.rs/eng/htm/konf2008/gen_phys_spec.pdf#page=105
29.Saleem U, Ahmad B, Rehman K, Mahmood S, Alam M, Erum A. Nephro-protective effect of vitamin C and Nigella sativa oil on gentamicin associated nephrotoxicity in rabbits. Pak J Pharm Sci. 2012; 25(4):727-30. [PMID]
30.Appenroth D, Fröb S, Kersten L, Splinter FK, Winnefeld K. Protective effects of vitamin E and C on cisplatin nephrotoxicity in developing rats. Arch Toxicol. 1997; 71(11):677-83. [DOI:10.1007/s002040050444] [PMID]
31.Kim SW, Jeon YS, Lee JU, Kang DG, Kook H, Ahn KY, et al. Diminished adenylate cyclase activity and aquaporin 2 expression in acute renal failure rats. Kidney Int. 2000; 57(4):1643-50. [DOI:10.1046/j.1523-1755.2000.00008.x] [PMID]
32.Lee J, Yoo KS, Kang DG, Kim SW, Choi KC. Gentamicin decreases the abundance of aquaporin water channels in rat kidney. Jpn J Pharmacol. 2001; 85(4):391-8. [DOI:10.1254/jjp.85.391] [PMID]
33.Sohn EJ, Kang DG, Lee HS. Protective effects of glycyrrhizin on gentamicin-induced acute renal failure in rats. Pharmacol Toxicol. 2003; 93(3):116-22. [DOI:10.1034/j.1600-0773.2003.930302.x] [PMID]
34.Grangé S, Bertrand DM, Guerrot D, Eas F, Godin M. Acute renal failure and Fanconi syndrome due to deferasirox. Nephrol Dial Transplant. 2010; 25(7):2376-8. [DOI:10.1093/ndt/gfq224] [PMID]