مقدمه
ویبریوکلرا یکی از مهم‌ترین باکتری‌های آلوده‌کننده آب و از پاتوژن‌های بسیار مهمی است که سالانه باعث مرگ تعداد زیادی از افراد در نقاط مختلف جهان می‌شود. مهم‌ترین عامل آلوده‌کنندگی این باکتری، توکسین کلرا است که سبب بروز بیماری حاد گوارشی می‌شود [1, 2, 3]. از سوی دیگر یکی از بزرگ‌ترین نگرانی‌های سازمان بهداشت جهانی و محققان این حوزه شناسایی غلظت‌های بسیار کم این باکتری است. در کنار شناسایی غلظت‌های کم پاتوژن‌ها، سرعت تشخیص نیز امری بسیار مهم تلقی می‌شود؛ به همین منظور روش‌های متنوعی برای شناسایی این باکتری ابداع شده و توسعه یافته است. روش‌هایی از قبیل کشت باکتری (روش استاندارد) و تشخیص مولکولی که امروزه نیز کاربرد زیادی دارد [7 ,6 ,5, 4]. با این حال روش معمول و سنتی شناسایی باکتری‌ها استفاده از محیط‌های کشت آگار است اما این روش بسیار وقت‌گیر و زمان‌بر بوده و نیاز به تشخیص چند مرحله‌ای دارد؛ دست‌یابی به نتایج اولیه در این روش سه تا چهار روز زمان می‌برد. علاوه بر این ممکن است به دلیل وجود باکتری‌های زنده غیرقابل کشت، نتایج منفی کاذب نیز مشاهده شود [9, 8]. به همین دلیل روش‌های تشخیصی دیگری جایگزین کشت این باکتری شده که امروزه با نام روش‌های تشخیص مولکولی شناخته می‌شوند. 
از روش‌های مولکولی می‌توان واکنش زنجیره‌ای پلیمراز ساده، مولتی پلکس پی‌سی‌آر، واکنش پلیمراز کمّی، تکثیر نوکلئیک اسید بر اساس توالی، تکثیر هم‌دمای وابسته به حلقه و تکنولوژی میکرواری (تراشه زیستی) را نام برد [10, 11 ,12, 13, 14]. همچنین در این خصوص از سلول‌های هیبریدومای دستکاری‌شده ژنتیکی حاوی پروتئین‌های بیولومیسنانس نیز در قالب حسگرهای زیستی استفاده شده است که کارایی و حد تشخیص این باکتری را افزایش داده است [15, 16]. با این حال روش‌های اشاره‌شده در بالا دارای معایب خاصی نیز هستند. برای مثال تشخیص باکتری ویبریو در نمونه‌های آب و غذای آلوده، به دلیل وجود ذرات همراه آن‌ها باعث مهار عملکرد آنزیم مولکولی خواهد شد. از سویی دیگر غلظت کم باکتری در آب و غذای آلوده نیز یک محدودیت برای روش‌های ذکرشده محسوب خواهد شد، به طوری که رسیدن به حد تشخیصی CFU 102 - 103 کار بسیار دشواری بوده و اغلب روش‌های استفاده‌شده به این حد تشخیصی نمی‌رسند. 
برای رفع این مشکل لازم است غلظت باکتری را افزایش داده تا با روش‌های مذکور امکان شناسایی آن مهیا شود. افزایش غلظت باکتری اغلب وابسته به کشت است، ولی می‌توان از روش‌های غیروابسته به کشت نیز استفاده کرد. تاکنون گزارش‌های متعددی در خصوص تغلیظ باکتری‌ها به صورت غیروابسته به کشت ارائه شده است. جداسازی باکتری‌های ویبریو کلرا از پلانگتون‌ها به منظور تصفیه آب شرب در کشور ما نیز توسعه یافته است. جداسازی با کمک فیلتر [17]، جداسازی باکتری Alicyclobacillus acidoterrestris از آب سیب [18] و جداسازی سویه‌های کرونو باکتر با استفاده از روش جداسازی ایمنی مغناطیسی از جمله این تحقیقات هستند [19] که همگی بیانگر مزیت روش‌های تغلیظ فیزیکی است. بنابراین هدف تحقیق حاضر تغلیظ باکتری ویبریوکلرا O1 با استفاده از روش فیزیکی و سریع فیلتراسیون و بررسی عملکرد این روش تغلیظی با روش کشت باکتری، واکنش زنجیره‌ای پلی مراز و سنجش ATP است.
مواد و روش‌ها
سویه باکتری استفاده‌شده در این تحقیق
در این مطالعه پژوهشی و تجربی، ویبریوکلرا O1 از بانک سلولی آزمایشگاه مرجع ایران (بیمارستان بوعلی) تهیه شد [12]. برای اطمینان از سالم بودن سویه باکتری دریافتی ابتدا در محیط LB تجاری (شرکت سیگما) کشت داده شد و سپس برای اطمینان نهایی از سویه باکتری، در محیط ‌TCBS‌‌ شرکت سیگما کشت داده شد. تشکیل کلنی‌های زرد رنگ بیانگر صحت باکتری ویبریو کلرا است. همچنین با انجام واکنش PCR از کلنی‌های زرد رنگ به دست آمده، با استفاده از پرایمرهای اختصاصی و مشاهده محصول تکثیریافته، صحت باکتری دریافت‌شده تأیید شد.
آماده‌سازی نمونه برای فیلتراسیون
8 میلی‌لیتر آب استریل به همراه 2 میلی‌لیتر باکتری با غلظت 109 CFU آلوده شد، سپس با کمک فیلترهای 0/45 میکرون شرکت واتمن (قابل جداسازی)، تمام 10 میلی‌لیتر نمونه آلوده‌شده از فیلتر عبور داده شد. باکتری از محیط جداسازی و تغلیظ شد و درنهایت با استفاده از پرایمرهای اختصاصی ویبریو کلرا (ompW) ،PCR و عملکرد آن با روش سنجش ATP مقایسه شد. 
جداسازی باکتری از فیلتر
با استفاده از پنس، فیلتر از نگه‌دارنده آن جدا شد و در پتری دیش حاوی یک میلی‌لیتر بافر نمکی فسفات قرار داده شد. در ادامه با کمک قاشق پلاستیکی روی فیلتر به صورت رفت و برگشت خراش داده شد. درنهایت یک میلی‌لیتر PBS حاوی باکتری در دور rpm 9000 به مدت 5 دقیقه سانتریفیوژ شد. رسوب باکتری به‌دست‌آمده در 200 میکرولیتر PBS حل شد تا از این مقدار برای انجام تست ATP ،PCR و کشت باکتری استفاده شود.
طراحی پرایمر و آماده‌سازی نمونه برای انجام PCR
به منظور انجام واکنش PCR پرایمرها با استفاده از نرم‌افزار Gene Runner برای ژن ompW طراحی و برای سنتز به شرکت Bioneer سفارش داده شد (جدول شماره 1) که محصولی با اندازه bp 498 را به وجود می‌آورد.
از هرکدام از نمونه‌های قبل و بعد از فیلتر و نمونه اولیه 50 میکرولیتر جدا شد. به مدت 20 دقیقه در آب جوشانده شد و به دنبال آن در 7000 دور در دقیقه به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ شد. از محلول رویی یک میکرولیتر به عنوان الگو در مخلوط PCR استفاده شد (مخلوط PCR به صورت تجمیعی "میکس" از شرکت فرمانتاز تهیه شد). در این مرحله حجم نهایی برای هر واکنش PCR، 5 میکرولیتر در نظرگرفته شد که شامل 2/5 میکرولیتر از مخلوط آنزیمی (Taq DNA polymerase)، 0/25 میکرولیتر (2/5 میکرومولار) از هرکدام از پرایمرها و یک میکرولیتر آب استریل است. در برنامه سیکل‌های دمایی نیز واسرشته شدن حرارتی اولیه در دمای 95 درجه سانتی‌گراد به مدت 10 دقیقه شامل یک چرخه و در ادامه با سی چرخه واکنش و دمای واسرشته شدن در دمای 94 درجه سانتی‌گراد به مدت یک دقیقه، اتصال پرایمرها در دمای 55 درجه سانتی‌گراد به مدت یک دقیقه، گسترش و تکثیر در دمای 72 درجه سانتی‌گراد به مدت یک دقیقه و درنهایت گسترش نهایی یک چرخه در دمای 72 درجه سانتی‌گراد به مدت 5 دقیقه انجام شد. از ترموسایکلر اپندورف نیز برای انجام واکنش استفاده شد؛ سپس محصولات واکنش در ژل یک درصد آگارز بررسی شدند.
همچنین برای ارزیابی واکنش‌های PCR، در نمونه‌های کنترل مثبت از ژنوم استخراجی ویبریو کلرا با استفاده از کیت شرکت تجاری پیشگام (GeneAll) استفاده شد.
آزمون ATP و آماده‌سازی نمونه 
20 میکرولیتر از باکتری‌های جداشده از فیلتر را در لوله‌های پلاستیکی مخصوص دستگاه لومینومتر (اسنپ) ریخته و سپس با استفاده از کیت تشخیص ATP شرکت نوراژن پیشرو (حاوی چهار بافر) و دستگاه لومینومتر شرکت هایجینا مدل EnSURE™ میزان نشر نوری نمونه‌های قبل و بعد از فیلتر بررسی شد. روش کار به این شکل بود که 20 میکرولیتر باکتری را با 7 میکرولیتر از بافر شماره 1، 13 میکرولیتر بافر شماره 2، 35 میکرولیتر از بافر شماره 3 و 165 میکرولیتر از بافر شماره 4 به ترتیب به اسنپ اضافه شد؛ سپس اسنپ به دستگاه انتقال داده شده و بعد از 15 ثانیه میزان نشر نوری لومیسنانس حاصل آزاد شدن ATP از نمونه‌های لیزشده باکتری ثبت شد.
شرایط کشت باکتری برای تعیین CFU
برای تعیین غلظت باکتری از روش پور پلیت استفاده شد [20]. باکتری بعد از کشت در محیط LB، قبل و بعد از فیلتر در محیط LB Agar شرکت سیگما به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتی‌گراد کشت داده شد تا با اطمینان بیشتری بتوان نتایج و تفاوت بین نمونه قبل و بعد از فیلتر را نمایش داد. برای تأیید نهایی نتایج، تمامی آزمون‌ها سه‌بار تکرار شد. 
یافته‌ها
برای ارزیابی تأثیر فیلتر بر جداسازی و تغلیظ باکتری 3 آزمایش انجام شد که با نام آزمایش 1-3 نام‌گذاری شد. در واقع آزمون‌های انجام‌شده هرکدام با شرایط و در روز‌های متفاوت بودند ولی آزمون‌های ATP ،PCR و کشت باکتریایی به طور جداگانه برای هر آزمون در یک زمان و یک روز انجام شده است؛ بنابراین نتایج آزمون‌‌های مشابه در کنار هم و در یک شکل نشان داده شده است.
ارزیابی عملکرد روش فیلتر با استفاده از کشت باکتریایی 
برای تأیید روش فیلتراسیون این کار سه‌بار با غلظت‌های متفاوت باکتری ویبریو کلرا انجام گرفت. نتایج مربوط به عملکرد قبل و بعد از روش فیلتراسیون با استفاده از آزمون کشت باکتری در تصویر شماره 1 نشان داده شده است.

مطابق تصویر در آزمایش شماره 1، غلظت باکتری قبل از فیلتر برابر با CFU 106×3 است اما با انجام فیلتراسیون میزان این غلظت به CFU 107×5/3 رسیده است.
ارزیابی عملکرد روش فیلتر با استفاده از آزمون ATP
طبق آزمایش‌های انجام‌شده و نتایج به دست آمده در تصویر شماره 2، میزان نشر نوری در نمونه‌های بعد از فیلتر حدوداً چهار برابر نمونه‌های قبل از فیلتر به دست آمد.

مطابق تصویر شماره 2 اختلاف نشر نوری در نمونه‌های قبل و بعد از فیلتر با یکدیگر مقایسه شد. 
ارزیابی عملکرد روش فیلتر با استفاده از PCR
علاوه بر آزمون‌های قبلی، روش PCR یکی دیگر از آزمایش‌های در نظر گرفته‌شده برای بررسی عملکرد و کارایی روش فیلتر در تغلیظ باکتری ویبریو کلرا بود. مطابق تصویر شماره 3 آنالیز محصول PCR با استفاده از ژل آگاروز و الکتروفورز بررسی شد و مشاهده باند bp 498 بیانگر تأیید آزمون مربوطه است. 

تعیین حساسیت روش فیلتر با استفاده از آزمونATP
در این آزمایش تلاش کردیم حد تشخیصی یا همان حساسیت روش فیلتر با استفاده از آزمون ATP را اندازه‌گیری کنیم. غلظت نمونه اولیه برابر با CFU 107 بود که با ساخت سریال رقت از باکتری، به غلظت CFU 102 رسید. بعد از انجام مراحل فیلتراسیون و آزمون ATP نتایج مطابق تصویر شماره 4 به دست آمد.

با این نتایج حساسیت تست ATP حدوداً برابر با CFU 103 تخمین زده شد.
تعیین حساسیت روش فیلتر با استفاده از PCR
هدف این آزمایش تعیین حساسیت روش فیلتر با کمک واکنش PCR است. در تصویر شماره 5 ژل آگاروز با واکنش‌های انجام‌شده به نمایش گذاشته شده است.

با مقایسه تصویرهای 5 الف و ب که نتایج واکنش PCR نمونه‌های تغلیظ‌شده و بدون تغلیظ را نشان می‌دهند، حساسیت تکنیک فیلتر CFU 101 تخمین زده می‌شود. 
بحث
روش‌های تغلیظ باکتری برای حذف مواد زاید و مهارکننده تست‌های تشخیصی و همچنین رفع مشکل تشخیص پاتوژن‌ها در نمونه‌های رقیق استفاده می‌شود. همان‌طور که بیان شد روش‌های تغلیظ و شناسایی مبتنی بر کشت بسیار زمان‌بر هستند. در این تحقیق از بین تمامی روش‌های تغلیظ موجود، از روش فیلتراسیون برای تغلیظ باکتری ویبریو کلرا استفاده شد. با توجه به نتایج به دست آمده در این تحقیق می‌توان روش فیلتر در تغلیظ باکتری ویبریو کلرا را روشی قابل اعتماد و کاربردی در حذف آلاینده‌ها، تغلیظ و جداسازی باکتری معرفی کرد. تأثیر فیلتر بر تغلیظ را به‌راحتی می‌توان با توجه به تصویر شماره 1 متوجه شد. مطابق تصویر شماره 1، در آزمایش شماره 1 غلظت باکتری قبل از فیلتر برابر با CFU 106×3 است اما با انجام فیلتراسیون میزان این غلظت بیشتر شده و به CFU 107×5/3 رسیده است که خود تأییدی بر کارایی تکنیک فیلتر و تأثیر آن بر تغلیظ باکتری است. همچنین بر اساس نتایج به‌دست‌آمده مطابق با تصویر شماره 2 میزان نشر نوری در نمونه‌های بعد از فیلتر حدوداً چهار برابر نمونه‌های قبل از فیلتر است که به‌راحتی اختلاف نشر نوری در نمونه‌های قبل و بعد از فیلتر تشخیص داده می‌شود. 
در تصویر شماره 3 نیز آنالیز محصول واکنش PCR با استفاده از ژل الکتروفورز، مرتبط با آزمایش شماره 2 نشان داده شده است. بر این اساس در چاهک شماره 4 که مربوط به نمونه قبل از فیلتر است، هیچ باندی مشاهده نشد اما بعد از فیلتر و انجام PCR درچاهک شماره 3 باند bp 498 به‌خوبی قابل مشاهده است. علاوه بر اینکه داده‌های کشت کارایی روش فیلتر را تأیید می‌کنند، نتایج حاصل از PCR نیز مکمل نتایج کشت باکتری است. تعیین حساسیت PCR هم تأیید دیگری بر این ادعاست. همان طور که در تصویر شماره 5 مشهود است، مقادیر CFU 101 تا 102 در قبل از فیلتراسیون نمونه آلوده به باکتری توسط PCR غیرقابل تشخیص است، حال آنکه پس از فیلتراسیون و بازیافت باکتری‌ها از روی فیلتر به‌راحتی شناسایی می‌شوند. 
لازم به ذکر است که مشکل اصلی روش تغلیظ با فیلتر بازیافت باکتری‌ها از فیلتر است؛ با روشی که استفاده شد، بازده بازیافت باکتری‌ها به 100 درصد رسید (تصویر شماره 1). در گزارش‌ها و تحقیقات قبلی نیز همین کارایی به دست آمده است. برای مثال در تحقیقی هوگ و همکارانش بر روی حذف آلودگی باکتری ویبریوکلرا از آب‌های آلوده از روش فیلتر استفاده کردند که این گروه نیز به بازده جداسازی 100 درصد با فیلتر دست یافتند [17]. در پژوهش دیگری که بورخ بر روی باکتری یرسینیا انجام داد، توانست باکتری را پس از فیلتر و انجام PCR در مدت‌زمان 6 تا 8 ساعت شناسایی کند [21]. میساوا و همکارانش نیز برای شناسایی سویه‌های باکتری کامپیلوباکتر از نمونه مدفوع انسان، از روش فیلتراسیون به همراه روش کشت جهت تغلیظ باکتری استفاده کردند. در این تحقیق با اینکه در اثر استفاده از دو روش غنی‌سازی، حساسیت تشخیص افزایش یافته بود اما همچنان به روش کشت‌های جامد بستگی داشت و به همین دلیل در تشخیص نمونه‌ها به دو روز زمان نیاز بود [22]. از دیگر روش‌های تغلیظ باکتری می‌توان به روش جذب سطحی با استفاده از نانوذرات مغناطیسی اشاره کرد که هادسون و همکارانش توانسته‌اند برای جداسازی باکتری لیستریا از نمونه‌های گوشت از آن استفاده کنند و در کمتر از 24 ساعت باکتری مذکور را جداسازی و با روش PCR شناسایی کنند [23]. ژائو نیز از نانوذرات مغناطیسی برای جداسازی بیومس آلودگی میکروبی استفاده کرد، در این تحقیق همزمان از فیلترهای گلاس فایبر نیز استفاده شد تا کارایی جداسازی باکتری از نمونه‌های آلوده بالا رود. نتایج به‌دست‌آمده بیانگر کارایی بالای روش از هر دو جنبه حد تشخیصی و بازیافت باکتری است [24]. ژانگ و همکارانش از یک روش اتوماتیکی با کارایی بالا برای تغلیظ و بازیافت باکتری ایشریشیا کولی با استفاده از روش فیلتر به کمک غشاهای سرامیک استفاده کردند و توانستند در زمان کمتر از یک ساعت به 90 درصد بازیافت باکتری دست یابد [25]. 
تمام روش‌هایی که بیان شد با هدف تغلیظ باکتری و فاصله گرفتن از محیط‌های کشت انجام شده است که می‌تواند بازدهی کار را تا حد بسیار زیادی بالا برد. در تحقیق حاضر ما با استفاده از روش فیلتراسیون و ارزیابی عملکرد آن با استفاده از سه روش شناسایی کشت باکتری، سنجش ATP و PCR توانسته‌ایم باکتری ویبریو کلرا را در مدت کمتر از سه ساعت شناسایی کنیم. همچنین حساسیت روش با استفاده از PCR در حدود CFU 10 ارزیابی شد، حال آنکه با استفاده از روش سنجش ATP به حدود CFU 103 دست یافتیم که در مقایسه با فعالیت دیگر محققان مطلوب ارزیابی می‌شود. تورنر و همکارانش از روش سنجش ATP برای شناسایی چند باکتری آلوده‌کننده آب و مواد غذایی نظیر ایشریشیا کولی و استافیلوکوکوس اورئوس استفاده کردند و به حد تشخیصی حدود CFU 102دست یافتند [26]. با بررسی روش‌های جدیدتر مثل روش‌های شناسایی بر مبنای آنتی‌بادی و کیت‌هایی که بر این اساس فعالیت می‌کنند، می‌توان حساسیت کار را افزایش داد [27] اما مسئله بسیار مهم ابداع و یافتن یک روش ساده است که بتوان با کمک آن با کمترین هزینه و ساده‌ترین روش حتی بدون وجود دانش در رشته زیست‌شناسی، اقدام به تغلیظ و تشخیص سریع پاتوژن‌ها کرد.
نتیجه‌گیری
در کل می‌توان نتیجه‌گیری کرد که کشت باکتری به منظور تشخیص و تغلیظ، با استفاده از روش فیلتر، حذف‌شدنی است، مخصوصاً زمانی که هدف باکتری ویبریوکلرا باشد؛ زیرا با استفاده از روشی که در این تحقیق استفاده شد، دُز عفونت‌زایی باکتری به‌راحتی قابل شناسایی است اما برای باکتری‌های حساس‌تر می‌توان از روش‌های جایگزین استفاده کرد [28]. درنتیجه هدف از این تحقیق را می‌توان در دو جنبه خلاصه کرد: 1. تغلیظ باکتری و کاهش زمان تشخیص باکتری، 2. استفاده از روشی ساده، سریع و کم‌هزینه با حساسیت تشخیصی مناسب برای باکتری ویبریوکلرا. البته در این روش نوع فیلتر و همچنین روش‌های جداسازی باکتری از فیلتر می‌تواند تعیین‌کننده حساسیت نتایج بوده و همین نکته از مشکلات و محدودیت‌های کار نیز به حساب می‌آید. هرچند با انتخاب جنس فیلتر مناسب می‌توان تا حد بسیار بالایی این مشکل را برطرف کرد.

ملاحظات اخلاقی
پیروی از اصول اخلاق پژوهش
این مقاله از نوع فراتحلیل است و نمونه انسانی و حیوانی نداشته است.

حامی مالی
این مقاله از پایان‌نامه کارشناسی ارشد نویسنده اول در گروه علوم زیستی، دانشکده مهندسی شیمی، دانشگاه صنعتی مالک اشتر، شاهین‌شهر، استخراج شده است. همچنین این مطالعه توسط انستیتوی تحقیقات علوم و فناوری بیولوژیکی دانشگاه صنعتی مالک اشتر حمایت مالی شده است.

مشارکت نویسندگان
مفهوم سازی، روش‌شناسی ، نگارش - پیش‌نویس اصلی و ویرایش: مهدی زین‌الدینی؛ تحقیق: ابوالفضل مرادی.

تعارض منافع
بنابر اظهار نویسندگان این مقاله تعارض منافع ندارد.
 

References
1.Maheshwari M, Nelapati K, Kiranmayi B. Vibrio cholerae-a review. Vet world. 2011; 4(9):423-8. [DOI:10.5455/vetworld.2011.423-428]
2.Faruque SM, Albert MJ, Mekalanos JJ. Epidemiology, genetics, and ecology of toxigenic Vibrio cholerae. Microbiol Mol Biol Rev. 1998; 62(4):1301-14. [DOI:10.1128/MMBR.62.4.1301-1314.1998] [PMID] [PMCID]
3.Bharati K, Ganguly NK. Cholera toxin: A paradigm of a multifunctional protein. Indian J Med Res. 2011; 133(2):179-87. [PMID] [PMCID]
4.Janda JM, Newton AE, Bopp CA. Vibriosis. Clin Lab Med. 2015; 35(2):273-88. [DOI:10.1016/j.cll.2015.02.007] [PMID]
5.Page AL, Alberti KP, Mondonge V, Rauzier J, Quilici ML, Guerin PJ. Evaluation of a rapid test for the diagnosis of cholera in the absence of a gold standard. PLoS ONE. 2012; 7(5):e37360. [DOI:10.1371/journal.pone.0037360] [PMID] [PMCID]
6.Vinothkumar K, Bhardwaj AK, Ramamurthy T, Niyogi SK. Triplex PCR assay for the rapid identification of 3 major Vibrio species, Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus, and Vibrio fluvialis. Diagn Microbiol Infect Dis. 2013; 76(4):526-8. [DOI:10.1016/j.diagmicrobio.2013.04.005] [PMID]
7.Law JW, Ab Mutalib NS, Chan KG, Lee LH. Rapid methods for the detection of foodborne bacterial pathogens : Principles, applications, advantages and limitations. Front Microbiol. 2015; 5:770. [DOI:10.3389/fmicb.2014.00770] [PMID] [PMCID]
8.Alam M, Sultana M, Nair GB, Siddique AK, Hasan NA, Sack RB, et al. Viable but nonculturable Vibrio cholerae O1 in biofilms in the aquatic environment and their role in cholera transmission. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007; 104(45):17801-6. [DOI:10.1073/pnas.0705599104] [PMID] [PMCID]
9.Aulet O, Silva C, Fraga SG, Pichel M, Cangemi R, Gaudioso C, et al. Detection of viable and viable nonculturable Vibrio cholerae O1 through cultures and immunofluorescence in the Tucumán rivers, Argentina. Rev Soc Bras Med Trop. 2007; 40(4):385-90. [DOI:10.1590/S0037-86822007000400002] [PMID]
10.Mousavi S M, Zeinoddini M, Azizi A, Saeedinia A, Monazah A. Molecular detection of zonula occludens toxin (zot) genes in Vibrio cholerae O1using PCR. Res Mol Med. 2017; 5(3):37-40. [DOI:10.29252/rmm.5.3.37]
11.Zeinoddini M, Saeedinia AR, Sadeghi V. [Rapid Detection of Vibrio Cholerae Using Hexaplex PCR Assay (Persian)]. J Police Med. 2014; 3(2):77-84. http://jpmed.ir/article-1-216-fa.html
12.Zeinoddini M, Saeedinia AR, Sadeghi V, Shamsara M, Hajia M, Rahbar M. Simple and accurate detection of Vibrio cholera using triplex dot blotting assay. Biomacromol J. 2015; 1(1):52-7. http://www.bmmj.org/article_12704.html
13.Yamazaki W, Seto K, Taguchi M, Ishibashi M, Inoue K. Sensitive and rapid detection of cholera toxin-producing Vibrio cholera using a loop-mediated isothermal amplification. BMC Microbiol. 2008; 8(94):1-7. [DOI:10.1186/1471-2180-8-94]
14.Shin HH, Seo JH, Kim CS, Hwang BH, Cha HJ. Hybrid microarray based on double biomolecular markers of DNA and carbohydrate for simultaneous genotypic and phenotypic detection of cholera toxin-producing Vibrio cholerae. Biosens Bioelectron. 2016; 79:398-405. [DOI:10.1016/j.bios.2015.12.073] [PMID]
15.Zamani P, Sajedi RH, Hosseinkhani S, Zeinoddini M, Bakhshi B. A luminescent hybridoma-based biosensor for rapid detection of V. cholerae upon induction of calcium signaling pathway. Biosens Bioelectron. 2016; 79:213-9. [DOI:10.1016/j.bios.2015.12.018] [PMID]
16.Zamani P, Sajedi RH, Hosseinkhani S, Zeinoddini M. Hybridoma as a specific, sensitive, and ready to use sensing element: A rapid fluorescence assay for detection of Vibrio cholerae O1. Anal Bioanal Chem. 2016; 408(23):6443-51. [DOI:10.1007/s00216-016-9762-y] [PMID]
17.Huq A, Xu B, Chowdhury MA, Islam MS, Montilla R, Colwell RR. A simple filtration method to remove plankton-associated Vibrio cholerae in raw water supplies in developing countries. Appl Environ Microbiol. 1996; 62(7):2508-12. [DOI:10.1128/AEM.62.7.2508-2512.1996] [PMID]
18.Wang Z, Wang J, Yue T, Yuan Y, Cai R, Niu C. Immunomagnetic separation combined with polymerase chain reaction for the detection of Alicyclobacillus acidoterrestris in apple juice. PLoS One. 2013; 8(12):e82376. [DOI:10.1371/journal.pone.0082376] [PMID] [PMCID]
19.Chen Q, Li Y, Tao T, Bie X, Lu F, Lu Z. Development and application of a sensitive, rapid, and reliable immunomagnetic separation-PCR detection method for Cronobacter spp. J Dairy Sci. 2017; 100(2):961-9. [DOI:10.3168/jds.2016-11087] [PMID]
20.Sanders ER. Aseptic laboratory techniques: Plating methods. J Vis Exp. 2012; (63):3064. [DOI:10.3791/3064] [PMID] [PMCID]
21.Lantz PG, Knutsson R, Blixt Y, Al-Soud WA, Borch E, Rådström P. Detection of pathogenic Yersinia enterocolitica in enrichment media and pork by a multiplex PCR: A study of sample preparation and PCR-inhibitory components. Int J Food Microbiol. 1998; 45(2):93-105. [DOI:10.1016/S0168-1605(98)00152-4]
22.Misawa N, Kawashima K, Kawamoto H, Kondo F. Development of a combined fltration-enrichment culture followed by a one-step duplex PCR technique for the rapid detection of Campylobacter jejuni and C. coli in human faecal samples. J Med Microbiol. 2002; 51(1):86-9. [DOI:10.1099/0022-1317-51-1-86] [PMID]
23.Hudson JA, Lake RJ, Savill MG, Scholes P, McCormick RE. Rapid detection of Listeria monocytogenes in ham samples using immunomagnetic separation followed by polymerase chain reaction. J Appl Microbiol. 2001; 90(4):614-21. [DOI:10.1046/j.1365-2672.2001.01287.x] [PMID]
24.Gao XL, Shao MF, Xu YS, Luo Y, Zhang K, Ouyang F, et al. Non-Selective separation of bacterial cells with magnetic nanoparticles facilitaed by varying surface charge. Front Microbiol. 2016; 7:1891. [DOI:10.3389/fmicb.2016.01891]
25.Zhang Y, Xu CQ, Guo T, Hong L. An automated bacterial concentration and recovery system for pre-enrichment required in rapid Escherichia coli detection. Sci Rep. 2018; 8(1):17808. [DOI:10.1038/s41598-018-35970-8] [PMID] [PMCID]
26.Turner DE, Daugherity EK, Altier C, Maurer KJ. Efficacy and limitations of an ATP-Based monitoring system. J Am Assoc Lab Anim Sci. 2010; 49(2):190-5. https://www.ingentaconnect.com/content/aalas/jaalas/2010/00000049/00000002/art00011#
27.Noble RT, Weisberg SB. A review of technologies for rapid detection of bacteria in recreational waters. J Water Health. 2005; 3(4):381-92. [DOI:10.2166/wh.2005.051] [PMID]
28.Schmid-Hempel P, Frank SA. Pathogenesis, virulence, and infective dose. PLoS Pathog. 2007; 3(10):1372-3. [DOI:10.1371/journal.ppat.0030147] [PMID] [PMCID]